JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Kupffer en veziküllü Gen Fonksiyonu ve Cilia Oluşturulan Akışkanın Görselleştirme Analizi

Published: March 31, 2013
doi:
10.3791/50038
, ,
1Department of Cell and Developmental Biology, State University of New York,Upstate Medical University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Eccles Institute of Human Genetics,University of Utah

Summary

Kupffer en veziküllü içinde Cilia üretilen sıvı akışı (KV) zebrafish embriyo sol-sağ desenlendirme denetler. Burada, KV hücrelerde özellikle gen fonksiyonu modüle bir teknik tarif. Ayrıca, sıvı akışını görselleştirmek için KV içine floresan boncuk sunmak için nasıl gösterir.

Abstract

Örneğin kalp, beyin ve bağırsak gibi iç organların normal işlevleri 1 için kritik olan sol-sağ (LR) asimetriler gelişebilir. Hareketli kirpikler fare, kurbağa, ve zebrafish 2-6 gibi omurgalı embriyolarının, LR asimetrisi kurma katılmaktadırlar. Bu 'LR kirpikler' organları 7 geliştirmek için LR desenlendirme bilgi sağlamak için düşünülmektedir sol lateral plaka mezoderm olarak kaskad sinyalizasyon korunmuş bir asimetrik Nodal (TGF-β süperailesi), tetiklemek için gerekli olan asimetrik akış oluşturur. Böylece, LR desenlendirme yatan mekanizmaları anlamak için, LR kirpikli hücrelerin organizasyonu, LR kirpikler ve sağlam asimetrik akış oluşturmak için yeteneklerini motilite ve uzunluğu düzenleyen genleri tanımlamak için gereklidir.

Zebrafish embriyo olarak, LR kirpikler 2,4,5 Kupffer en vesikül (KV) yer almaktadır. KV monociliated epitel hücreleri, tek bir tabaka oluşurBir sıvı dolu lümen içine aldığınız. Fate eşleme KV epiboly aşamaları sırasında 8,9 dorsal blastoderm kenar az göç dorsal haberci hücreleri (DFCS) olarak bilinen ~ 20-30 bir grup hücre elde edilir olduğunu göstermiştir. Erken somite aşamalarında, DFCS küme ve kirpikli epitel hücreleri içine ayırt embriyonun 10,11 tailbud KV oluşturur. Belirlemek ve izlemek için yeteneği DFCS-kombinasyon optik şeffaflık ve zebrafish KV LR kirpikli hücreleri incelemek için mükemmel bir model sistem embriyo-make zebrafish hızla gelişmesi ile.

İlginçtir, DFC / KV hücre soyunun ataları 4 saat sonrası fertilizasyon (HPF) ile sarısı hücresi arasındaki sitoplazmik köprüler kadar korumak, 2 hpf 8 sonrası yakın sarısı hücre ve diğer embriyonik hücreler arasında sitoplazmik köprüler oysa. Bu sitoplazmik köprü yararlanan biz morfolino oligonucle sunmak için bir sahne özgü enjeksiyon stratejisi geliştirdiDFCS ve devirme bu hücreler 12 bir hedef genin işlevi sadece otides (MO). Bu teknik, gen fonksiyonunun bir vahşi-tip embriyo bağlamında gelişen DFC / KV soy nakavt edildiği kimerik embriyolar oluşturur. KV asimetrik akış analiz etmek, biz KV lümeni ve videomicroscopy 2 kullanarak kayıt boncuk hareketin içine floresan mikroboncukları enjekte. Akışkan akışı kolaylıkla görülebilmektedir ve zamanla boncuk yerinden izleme ile belirlenebilir.

Burada sahne özgü DFC hedefli gen Knockdown tekniği ve akış görselleştirmek için KV içine floresan mikroboncuk enjeksiyon kullanılarak, biz KV gelişimi ve işlevi sırasında belirli bir genin rolü karakterize için etkili bir yaklaşım sağlayan bir protokol mevcut.

Protocol

Sahne Özgü Zebra balığı embriyo Enjeksiyonlar genel bakış Bir hedef mRNA bağlamak ve bu transkript protein ekspresyonu bozmak antisens oligonükleotidler morfolino (MO), yaygın çalışmalar zebrafish 13,14 içinde (-kaybı fonksiyonu) gen devirme kullanılmaktadır. Gene Araçlar, LLC floresan mikroskopi kullanılarak enjekte edilen embriyolar MO tespit carboxyfluorescein (yeşil floresans yayar) veya lissamine (kırmızı floresans yayar) biriyle etiketlenmiş MOs sunmakta…

Representative Results

Sahne özgü MO enjeksiyonlar embriyonun belirli bölümlerinde gen fonksiyonlarını analiz için kullanışlı bir yaklaşım sağlar. Şekil 1 akış görselleştirmek için floresan boncuk tanıtmak DFC / KV hücrelerinde ve nasıl gen işlevi sınamak için kullanılan enjeksiyon stratejilerinin bir akış şeması sunuyor KV. Başarılı bir aşama özgü enjekte edilen embriyolar floresan MO dağılımı Şekil 1B-F ve Şekil 2 'de canlı embriyolar şematik …

Discussion

DFC / KV hücre soyu için MO hedeflemek için sahne özel enjeksiyonlar kullanarak gen fonksiyonu hücre özerklik incelemek ve küresel gen demonte neden pleiotropik fenotipleri önlemek için faydalı bir yaklaşımdır. Ancak, bu enjeksiyonları teknik olarak zor olabilir. 256 hücreli ve 1000-hücre aşamaları arasında MO enjeksiyon üç olası sonuçlara neden olabilir: 1) MO sarısı boyunca MO yayılır) enjeksiyon yerinde, 2 toplanır kalır ve DFC / KV hücreleri veya 3) MO girer sarısı boyunca yayılır v…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz mükemmel laboratuvar desteği ve zebrafish bakımı için Fiona Foley ederim. Bu eser bir GW AHA predoctoral dostluk (11PRE5730027) ve HJY (R01HL66292) ve JDA (R01HL095690) için NHLBI hibe desteklenmiştir.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number
Standard Control oligo-Lissamine tagged Gene Tools, LLC
Custom Rock2b morpholino oligo Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres Polysciences, Inc. 24054
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, M. J., Ware, S. M. Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).
  2. Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. Kupffer’s vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut. Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).
  3. Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
  4. Essner, J. J., et al. Conserved function for embryonic nodal cilia. Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).
  5. Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer’s vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).
  6. Schweickert, A., et al. Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus. Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).
  7. Tabin, C. J. The key to left-right asymmetry. Cell. 127 (1), 27-32 (2006).
  8. Cooper, M. S., D’Amico, L. A. A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation. Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).
  9. Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula. Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).
  10. Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer’s vesicle in zebrafish. Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).
  11. Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish. Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).
  12. Amack, J. D., Yost, H. J. The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry. Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).
  13. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
  14. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  15. Kimmel, C. B., Law, R. D. Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells. Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).
  16. Arrington, C. B., Yost, H. J. Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo. Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).
  17. Caron, A., Xu, X., Lin, X. Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer’s vesicle. Development. 139 (3), 514-524 (2012).
  18. Wang, G., et al. The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer’s vesicle in zebrafish. Development. 138 (1), 45-54 (2011).
  19. Aamar, E., Dawid, I. B. Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer’s vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish. Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).
  20. Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia. Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).
  21. Schneider, I., et al. Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning. Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).
  22. Matsui, T., et al. Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer’s vesicle organogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).
  23. Shu, X., et al. Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning. Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).
  24. Esguerra, C. V. Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination. Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).
  25. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  26. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  27. Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
  28. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  29. Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning. Development. 135 (1), 75-84 (2008).
  30. Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish. Development. 138 (2), 291-302 (2011).
  31. Matsui, T., Bessho, Y. Left-right asymmetry in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. , (2012).

Tags

Keywords: Gene FunctionCiliaKupffer’s VesicleLeft-right AsymmetryFluid FlowZebrafishDorsal Forerunner CellsMorpholino KnockdownVideomicroscopy
check_url/50038?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D. Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer’s Vesicle. J. Vis. Exp. (73), e50038, doi:10.3791/50038 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image