Capilar Fuerza Litografía Cardiaca de Ingeniería de Tejidos

Summary

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Abstract

La enfermedad cardiovascular sigue siendo la causa principal de muerte en todo el mundo ^1. Ingeniería de tejidos cardíacos es muy prometedora para entregar los descubrimientos médicos innovadores con los objetivos de desarrollo de tejidos funcionales para la regeneración cardiaca, así como ensayos de cribado in vitro. Sin embargo, la capacidad de crear modelos de alta fidelidad de tejido del corazón ha demostrado ser difícil. Matriz extracelular del corazón (ECM) es una estructura compleja que consta de dos señales bioquímicas y biomecánicas que van desde la micro-a la escala del nanómetro ^2. Local condiciones de carga mecánica y las interacciones célula-ECM han sido recientemente reconocida como componentes vitales en la ingeniería de tejido cardíaco ^3-5.

Una gran parte de la MEC cardiaca se compone de fibras de colágeno alineados con diámetros de nano-escala que influye significativamente en la arquitectura del tejido y el acoplamiento electromecánico ^2. Por desgracia, algunos métodos VHAe sido capaz de imitar la organización de las fibras de ECM a la escala nanométrica. Los recientes avances en las técnicas de nanofabricación, sin embargo, han permitido el diseño y la fabricación de andamios escalables que imitan las señales in vivo de rigidez estructural y del sustrato en del ECM en el corazón ^{de 6-9.}

Aquí se presenta el desarrollo de dos reproducible, procesos nanoestampación escalables para la alineación funcional de las células cardiacas utilizando el poli biocompatible de polímero (láctico-co-glicólico) (PLGA) ⁸ y una de poliuretano (PU) de polímero a base rentable y. Estos sustratos anisotrópicamente nanofabricados (ANF) imitan el ECM subyacente de tejidos, alineados bien organizadas y se puede utilizar para investigar el papel de nanotopografía sobre la morfología celular y la función ^10-14.

El uso de un nanoestructurada (NP) maestro de silicio como una plantilla, un acrilato de poliuretano (PUA) de molde se fabrica. Este molde PUA se utiliza entonces para PAttern hidrogel PU o PLGA mediante UV-asistida o fuerza capilar litografía-solvente mediada (CFL), respectivamente ^15,16. Brevemente, PU o PLGA de pre-polímero es gota dispensado sobre un cubreobjetos de vidrio y el molde PUA se coloca en la parte superior. Para CFL UV asistida, la PU se expone entonces a la radiación UV (λ = 250-400 nm) para el curado. Para disolvente mediada CFL, el PLGA se graba en relieve el uso de calor (120 ° C) y presión (100 kPa). Después del curado, el molde PUA se despega, dejando atrás un ANF para el cultivo celular. Las células primarias, como los miocitos ventriculares de rata neonatal, así como los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes humanas, se pueden mantener en la ANF ^2.

Introduction

La enfermedad cardiovascular es la principal causa de morbilidad y mortalidad en el mundo y presenta una carga socioeconómica de peso en un ^1,17 sistema mundial de salud ya tensas. Ingeniería de tejidos cardíacos tiene dos objetivos distintos: (1) para regenerar el miocardio dañado después de la enfermedad isquémica o miocardiopatía o (2) para crear un modelo de alta fidelidad del corazón para la detección in vitro de drogas o la modelización de enfermedades.

El corazón es un órgano complejo que se debe trabajar constantemente para suministrar sangre al cuerpo. Estructuras laminares densamente poblado de cardiomiocitos y tejidos de soporte están dispuestos en patrones helicoidales a lo largo de la pared del corazón ^18,19. El corazón también se acopla electromecánicamente ²⁰ de una manera muy coordinada para expulsar de manera eficiente la sangre al cuerpo ^21. Varios obstáculos importantes siguen pendientes de resolución, sin embargo, antes de que el intrincado diseño de la naturaleza de forma fiable puede ser recapitulado in vitro.En primer lugar, aunque los métodos de diferenciación de los cardiomiocitos robustos siguen elaborando ^22, HPSC-CM, aún subsisten algunos fenotipos más inmaduros. Sus propiedades electromecánicas y morfología coincide más estrechamente los niveles fetales ^23. En segundo lugar, cuando se mantienen en condiciones de cultivo tradicionales, tanto derivado de células madre y cardiomiocitos primarios logran ensamblarse en estructuras como tejidos nativos. Por el contrario, las células se vuelven orientados al azar y no presentan la apariencia en forma de barra con banda de miocardio adulto ^24.

La matriz (ECM) entorno extracelular con la que interactúan las células juega un papel importante en numerosos procesos celulares ^11,13,25. El ECM consiste en señales moleculares y topográficas complejas, bien definidos que influyen significativamente en la estructura y función de las células ^6,26. Dentro del corazón, alineación celular sigue de cerca las fibras de ECM escala nanométrica subyacente ^2. El impacto de estos nanotopographseñales iCal en la célula y la función del tejido, sin embargo, está lejos de ser completamente entendido. Los estudios preliminares de la interacción célula-biomaterial escala nanométrica indican la importancia potencial y el impacto de sub-micrones señales topográficas para la señalización celular ^27, la adhesión ^28-30, un crecimiento del ^31, y la diferenciación ^32,33. Sin embargo, debido a la dificultad en el desarrollo de sustratos nanofabricados reproducibles y escalables, tales estudios podrían no reproducir los efectos celulares a escala múltiple del complejo ambiente de ECM en vivo. En este protocolo, una técnica de nanofabricación sencillo y rentable para producir andamios de cultivo de células que imitan la alineación de la fibra nativa ECM cardiaca se describe, lo que permite una amplia gama de nuevas investigaciones de las interacciones-cardiomiocitos biomaterial. La comprensión de cómo los cardiomiocitos interactúan con el ambiente de ECM nanoescala podría permitir la capacidad de controlar el comportamiento celular para reproducir con mayor fidelidad función tejido nativoción. Por otra parte, las monocapas celulares son un sistema experimental simplificado en comparación con las estructuras en 3D, pero todavía exhiben un comportamiento multicelular complejo para investigaciones profundas y selección funcional ^2,34-36. Finalmente, tales andamios se podrían utilizar para mejorar la función celular del injerto cuando se implanta en el corazón para propósitos de regeneración ^37.

Protocol

Todos los procedimientos se realizaron a temperatura ambiente (~ 23 ° C) a menos que se indique lo contrario. 1. Fabricación de Silicon Maestro Limpio oblea de silicio con etanol al 100% o xileno y se seca a O 2 / N 2 de gas. Coloque oblea de silicio en Spin-revestidor a velocidades de rotación de 2.000-4.000 rpm para producir una película de espesor de 0,3-0,5 micras. Patrón de la película fotorresistente con las dimensiones correct…

Representative Results

La figura 1 es una vista general esquemática del proceso de producción para los dos métodos de fabricación. Debido a la difracción de la luz causada por la topografía a escala nanométrica, nanoestampación debe resultar en una superficie iridiscente a la ANF. Figura 2 representa esta superficie iridiscente en un 25 mm NP-PU cubreobjetos bien modelada (Figura 2A) con cresta 800 nm y la ranura ancho (Figura 2B). El aspecto iridiscente de la ANF var…

Discussion

Tejidos cardíacos Funcionalmente maduros carecen de tanto in vivo como in vitro en aplicaciones de ingeniería de tejido cardíaco. Los métodos de nanofabricación CFL descritos aquí son técnicas robustas para lograr la alineación celular e influir en la función del tejido macroscópico debido a la escalabilidad del sistema. Grandes áreas pueden ser fácilmente modelados y se utilizan para el cultivo de células. Alineación celular macroscópico es esencial en la ingeniería de tejido cardiaco con el fi…

Materials

Name	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Fibronectin	BD Biosciences	354008
NOA 76	Norland Products, Inc.	7606B
Surface Adhesion Promotor (Glass Primer)	Minuta Tech
PUA	Minuta Tech	MINS-311RM
Soft Rubber Roller	Speedball
Silicon Wafers	NOVA Electronic Materials	FA01-9900
Photoresist	Shipley	SPRT510
Photoresist Developer	Shipley	MF320
Electron-Beam Lithography System	JEOL	JBX-9300FS
Etching System	Surface Technology Systems	NP10 8UJ
Plasma Asher System	BMR Technology Co.	DSF-200
Ozone Cure System	Minuta Tech	MT-UV-O- 08
Fusion Cure System	Minuta Tech	MT-UV-A 11
NOA 83H	Norland Products, Inc.	8301
Spin Coater	Laurel Technology	WS-400-6NPP
Skyrol PET Film	SKC Co., Ltd.	23038-59-9
25mm Glass Slides	Corning	2948
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning	6/5/2553
Poly(D,L-lactide-co-glycolide)	Sigma-Aldrich	P2191-1G
Chloroform	Sigma-Aldrich	372978-1L
500g Weights	Global Insustrial	T9FB503120
Isopropyl Alcohol	EMD Millipore	PX1835-2
Hot Plate	Corning	PC-420D
Sonicator	Branson	B2510MTH