Il test della cometa è un modo efficiente di rilevare rotture a singolo e doppio filamento, compresi alcali-labili siti e DNA-DNA/DNA-protein legami incrociati sul DNA in tutte le cellule, compresi i neuroni dell'ippocampo. Il metodo sfrutta la migrazione differenziale di DNA in un campo elettrico dovuto a differenze nelle quantità di danno al DNA.
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Articolo metodologico
Il saggio danneggiare il DNA in neuroni ippocampali Utilizzo del Comet Assay
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un certo numero di farmaci indirizzare i percorsi di riparazione del DNA e indurre cellule uccidere con la creazione di danno al DNA. Così, i processi per misurare direttamente il danno al DNA sono stati ampiamente valutati. I metodi tradizionali sono in termini di tempo, costosa, molte risorse e richiedono cellule replica. In contrasto, il test della cometa, un unico gel test cellulare elettroforesi, è più veloce, non invasivo, economico, misura diretta e sensibile di danno e riparazione del DNA. Tutte le forme di danno al DNA e riparazione del DNA possono essere visualizzate a livello di singola cellula utilizzando questa tecnica potente.
Il principio alla base del test della cometa è che il DNA intatto è altamente ordinato che i danni del DNA sconvolge questa organizzazione. Le sorgenti di DNA danneggiato nella matrice di agarosio e quando sottoposto ad un campo elettrico, il DNA carico negativamente migra verso il catodo, che è caricato positivamente. Le grandi filamenti di DNA non danneggiati non sono in grado di migrare lontano dal nucleo. Danno al DNAcrea frammenti di DNA più piccole che viaggiano oltre la DNA intatto. Comet Assay, un software di analisi delle immagini, misure e confronta l'intensità complessiva fluorescente del DNA nel nucleo con il DNA che è migrata dal nucleo. Segnale fluorescente dal DNA migrato è proporzionale al danno del DNA. Coda DNA più lungo luminoso indica il danno al DNA è aumentato. Alcuni dei i parametri che vengono misurati sono momento tail che è una misura della sia la quantità di DNA e distribuzione del DNA nella lunghezza tail, tail e percentuale di DNA nella coda. Questo test permette di misurare la riparazione del DNA e da risoluzione del danno al DNA significa riparazione ha avuto luogo. Il limite di sensibilità è di circa 50 rotture di filamenti per 1,2 cellula diploide mammiferi. Cellule trattati con un qualsiasi agenti DNA dannosi come etoposide, possono essere utilizzato come controllo positivo. Così il test della cometa è una procedura rapida ed efficace per misurare la danno al DNA.
Protocollo
1. Colture Cellulari
- Cellule Cultura neuronali e trattarli come necessario.
- Cellule Harvest in provette da 15 ml: i media aspirato, sciacquare con tampone fosfato salino (PBS, calcio e magnesio libero), aggiungere tripsina, raccogliere in provette da 15 ml e neutralizzare tripsina con appropriati mezzi di siero contenenti.
- Centrifugare a 1.000 xg per 5 min.
- Aspirare media.
- Risospendere le cellule in PBS.
- Centrifugare a 1.000 xg per 5 min.
- Aspirare media e Risospendere le cellule in PBS fresco.
- Contare le celle utilizzando un emocitometro o il vostro contatore di cellule preferito. <....
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Discussione
Il test della cometa ha la capacità unica di analizzare cellule singole. Ciò è vantaggioso in identificazione di sottopopolazioni di cellule che dimostrano risposta differenziale ad agenti citotossici. Alcune limitazioni pratiche devono essere presi in considerazione. Il numero di celle che possono essere valutati singolarmente possono variare a seconda dell'individuo. La dimensione del campione deve essere aumentato se vi sono variazioni nei danni al DNA all'interno di una popolazione. Vitale cella singola sosp.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Premio IMPACT del Dipartimento di Radioterapia Oncologica, University of Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, Cancer Foundation i bambini da combattimento, e la Gabrielle Angelo Foundation (a ESY.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| 1,5 ml provette | Santa Cruz Biotechnology, Inc | Sc-200271 | |
| 10X TBE (Tris base, acido borico, EDTA) | Fisher Scientific | BP13331 | |
| Provetta da 15 ml | Fisher Scientific | 0553851 | |
| Agarosio | Sigma | A5093 | |
| Alluminio foil | Fisher Scientific | 01213101 | |
| Coppa | Fisher Scientific | FB102300 | |
| Centrifuga | Thermo Scientific | 75004261PR | |
| Comet Assay software | Comet Assay IV System Image Analysis | ||
| Cilindro | Fisher Scientific | 08555F | |
| EDTA | GIBCO | 15575 | |
| Elettroforesi camera di | Thermo Scientific | 09528101 | |
| Etanolo | Fisher Scientific | A407P4 | |
| Microscopio a fluorescenza | Zeiss Axio Vision | Ogni microscopio a fluorescenza con filtro verde sarà sufficiente | |
| Emocitometro | Fisher Scientific | 0267152 | |
| Basso punto di fusione agarosio | Promega | V2111 | |
| Microonda | Sears | ||
| Soluzione tampone fosfato, calcio libero, magnesio libero | HyClone | SH3025601 | |
| Alimentazione | BioRad | 1645050 | |
| Frigorifero | Sears | ||
| Righello | Staples | ||
| Scorrere | Fisher Scientific | 12550143 | |
| Cloruro di sodio | Sigma | S7653 | |
| Soda caustica | Sigma | S5881 | |
| Sodio lauril sarcosinato | Fisher Scientific | S529 | |
| SYBR Green | Invitrogen | S7585 | |
| Vassoio | Fisla scientifica | 15242B | |
| Tris Base | Sigma | T6066 | |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Tripsina | HyClone | SH3023601 | |
| Vortice | Fisher Scientific | 02216108 | |
| Bagnomaria | Fisher Scientific | 154622Q |
Riferimenti
- Olive, P. L., Banath, J. P. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).
- Hovhannisyan, G. G. Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleu....
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Ristampe e permessi
