Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T
Summary
אנו מתארים assay תא בודד תפוקה גבוהה למדוד cytotoxicity של תאי T כאשר דגר עם תאי המטרה סרטניים. שיטה זו מעסיקה, מערך אלסטומרי צפוף של תת nanoliter בארות (~ 100.000 / מערך בארות) מרחבית להגביל את תאי T ותאי מטרה ביחסים מוגדרים ומצמידה למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לפקח נטייה-היעד פעיל ואפופטוזיס שלאחר מכן.
Abstract
טיפול חיסוני סרטן יכול לרתום את הספציפיות של תגובה חיסונית למקד ולחסל גידולים. טיפול בתאים מאמץ (ACT) המבוססים על העברת המאמצת של תאי T המהונדס גנטי כדי לבטא רצפטור אנטיגן chimeric (CAR) הראה הבטחה רבה במחקרים קליניים 1-4. ישנם מספר יתרונות לשימוש ברכב + תאי T לטיפול בסרטן, לרבות היכולת למקד אנטיגנים מוגבלים שאינם MHC וfunctionalize תאי T להישרדות אופטימלית, הביות והתמדה בתוך פונדקאי, ולבסוף לגרום לאפופטוזיס של מכונית + תאי T במקרה של רעילות מארח 5.
תיחום הפונקציות האופטימליות של רכב + תאי T הקשורים לתועלת קלינית הם חיוניים לעיצוב הדור הבא של ניסויים קליניים. התקדמות בהדמית חי כמו מיקרוסקופיה multiphoton חולל מהפכה בחקר תפקוד תא חיסוני אניn vivo 6,7. בעוד שמחקרים אלה קדמו את ההבנה של פונקציות תא T in vivo, ACT מבוסס תאי T בניסויים קליניים שלנו דורש את הצורך לקשר תכונות מולקולריות ופונקציונליות של הכנות תא T-עירוי מראש עם פוסט עירוי יעילות קלינית, על ידי ניצול ב מבחני חוץ גופיית ניטור תפקודי תא T כמו, והפרשת ציטוקינים cytotoxicity. מבחנים מבוססי הזרימה cytometry סטנדרטיים שפותחו לקבוע את התפקוד הכללי של אוכלוסיות תאי T ברמת התא בודד, אבל אלה אינם מתאימים לניטור צמודה והיווצרות חיים או את היכולת של אותו התא כדי להרוג מטרות מרובות 8.
מערכי microfabricated תוכננו בפולימרים ביולוגיים כמו polydimethylsiloxane (PDMS) הם שיטה אטרקטיבית במיוחד מרחבית להגביל effectors ויעדים בנפחים קטנים 9. בשילוב עם מיקרוסקופיה אוטומטית זמן לשגות פלואורסצנטי, thousands של אינטראקציות-היעד פעיל ניתן לפקח בו זמנית על ידי בארות בודדות הדמיה של מערך nanowell. אנו מציגים כאן שיטת תפוקה גבוהה לניטור cytotoxicity תיווך תאי T ברמת התא בודד שיכול להיות מיושמת באופן נרחב ללימוד הפונקציונלי cytolytic תאי טי.
Protocol
Representative Results
Discussion
נציין כאן את הפרוטוקול לבדיקת cytolytic תפוקה גבוהה מתא בודד אפשרה באמצעות שיתוף דגירה של effectors ויעדים במערכים של nanowells (איור 1). בנוסף לתפוקת יתרון עיקרי של השיטה הוא היכולת לנטר cytotoxicity פעיל בתיווך כנגד תאי המטרה רצויה ללא צורך בהנדסת תא היעד אשר בתורו מאפשר לשימ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר דיווח בפרסום זה היה נתמך על ידי מכון הלאומי לחקר הסרטן של המכון הלאומי לבריאות תחת מספר הפרס R01CA174385. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
| Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
| SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
| Dulbecco’s PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
| Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
| Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
| 4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
| Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
| Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
| Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
| 15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
| Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |
References
- Louis, C. U., et al. Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma. Blood. 118, 6050-6056 (2011).
- Savoldo, B., et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N. Engl. J. Med. , (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).
- Varadarajan, N., et al. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).
- Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies. Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).
- Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research. Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).
- Makedonas, G., Betts, M. R. Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV. Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).
- Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry. Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).
