Förfarande för decellularisering av grishjärta genom retrograd koronarperfusionstrycket
Summary
En metod för att snabbt och fullständigt avlägsna cellulära komponenter från en intakt grishjärta genom retrograd perfusion beskrivs. Denna metod ger en platsspecifik hjärt extracellulär matrix byggnadsställning som har potential för användning i flera kliniska tillämpningar.
Abstract
Perfusion-baserade helt organ decellularisering har nyligen vunnit intresse inom området för vävnadsteknik som ett medel för att skapa platsspecifika extracellulära matrix ställningar, medan i hög grad bevarar den nativa strukturen av byggnadsställningen. Hittills har detta tillvägagångssätt använts i en mängd olika organsystem, däribland hjärta, lunga, lever och 1-5. Tidigare decellularisering metoder för vävnader utan en lättillgänglig vaskulär nätverk har åberopas långvarig exponering av vävnad för lösningar av detergenter, syror, eller enzymatiska behandlingar såsom ett medel för att avlägsna de cellulära och nukleära komponenter från omgivande extracellulära miljön 6-8. Men hur effektivt dessa metoder gångjärn på förmågan hos de lösningar genomsyrar vävnaden via diffusion. Däremot minskade perfusion av organ genom naturliga kärlsystemet effektivt spridning avstånd och underlättade transporter av decellularizatipå medel i vävnaden och cellulära komponenter från vävnaden. Häri beskriver vi en metod för att helt decellularize en intakt grishjärta genom koronar retrograd perfusion. Protokollet gav en helt decellulariserad hjärt extracellulär matrix (c-ECM) byggnadsställning med den tredimensionella strukturen för hjärtat intakt. Vår metod använde en serie av enzymer, detergenter, och syror i kombination med hypertona och hypoton sköljmedel för att underlätta lys och avlägsnande av celler. Protokollet använde en trypsinlösning att lösgöra celler från matrisen följt av Triton X-100 och natriumdeoxicholat lösningar för att underlätta avlägsnande av cellulärt material. Den beskrivna protokollet använder också perfusion hastigheter större än 2 l / min under längre tidsperioder. Den höga flödeshastigheten, tillsammans med lösning förändringar tillåtna transport av medel till vävnaden utan förorening av cellrester och säkerställt effektiv sköljning av vävnaden. Den beskrivna metoden bort alla kärnämne från Native porcin hjärtvävnad, skapar en platsspecifik hjärt ECM byggnadsställning som kan användas för en mängd olika tillämpningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den aktuella studien beskrivs metoder för konsekvent och effektiv decellularisering av en gris hjärta. Protokollet var en modifiering till en tidigare publicerad rapport 1, och inkluderade längre exponering för flöde och ökat tryck, vilket gav mer repeterbara resultat. Den resulterande decellulariserade vävnaden uppfyllde alla de kriterier som offentliggörs för framgångsrik decellularisering av vävnad 2. Täta lösning förändringar utfördes för att begränsa återinförandet av cellm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna Brogan Guest, Michelle Weaver, och Kristen Lippert. Finansiering för denna studie gavs av NIH Grant R03EB009237, liksom NIH utbildningsstipendier T32EB001026-06 från National Institute of Biomedical Imaging och bioteknik och T32HL076124-05.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
References
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
- Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model–generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
- Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
- Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
- Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).
