एलिगेंस Chemotaxis परख
Summary
मात्रात्मक की chemotactic प्रतिक्रिया के मूल्यांकन की पद्धति<em> Caenorhabditis एलिगेंस</em> वर्णित है. एक chemotactic सूचकांक (सीआई) ठीक निश्चित लक्ष्य को कीड़े की प्रतिक्रिया का मूल्यांकन, और दबाव और ब्याज की यौगिकों के बीच तुलना के लिए एक मंच के रूप में सेवा करने के लिए एक रास्ते के रूप में कार्यरत था.
Abstract
कई जीवों कीमोटैक्सिस, खाद्य स्रोतों बाहर की तलाश हानिकारक पदार्थों से बचने, और साथियों को खोजने के लिए उपयोग करें. Caenorhabditis एलिगेंस प्रभावशाली कीमोटैक्सिस व्यवहार किया है.
एक odorant को कीड़े की प्रतिक्रिया का परीक्षण करने के पीछे आधार यह एक क्षेत्र में उन्हें जगह और एक odorant के जवाब में पैदा आंदोलन का पालन है. यहां तक कि कई उपलब्ध assays के साथ, एक महत्वपूर्ण नमूना आकार को बनाए रखते हुए, एक दूसरे के साथ कीड़े की बातचीत, जबकि न्यूनतम नियंत्रण और परीक्षण दोनों क्षेत्रों के सापेक्ष स्थान शुरू कीड़ा अनुकूलन प्रगति 1-10 में एक काम रहता है. यहाँ वर्णित विधि Bargmann एट अल. 1 द्वारा विकसित की परख संशोधित करके इन मुद्दों का समाधान करना है. एक पेट्री डिश चार quadrants में बांटा गया है, 'टेस्ट मैच' और दो के रूप में चिह्नित दो विपरीत चतुर्भागों "नियंत्रण" नामित कर रहे हैं. संवेदनाहारी सभी परीक्षण और नियंत्रण साइटों में रखा गया है. कीड़े एक circl साथ थाली के केंद्र में रखा जाता हैई गैर चलता – फिरता कीड़े ध्यान नहीं दिया जाएगा कि यह सुनिश्चित करने के लिए मूल के आसपास चिह्नित. एक चार चतुर्थ भाग प्रणाली का उपयोग करने के बजाय एक 2 या दो 1 की परवाह किए बिना वे शुरू किया मूल के पक्ष में, वे परीक्षण और नियंत्रण के नमूने से समान दूरी पर स्थित हैं, के रूप में कीड़े के आंदोलन में पूर्वाग्रह समाप्त. इस कीड़े देरी या उन्हें अपने निर्धारित पथ से एक गलत व्याख्या उपज, एक अधिक घुमावदार मार्ग लेने के लिए मजबूर कर सकते हैं जो एक odorant, पर प्रतिक्रिया के लिए अन्य कीड़े का एक समूह के माध्यम से यात्रा करने के लिए मजबूर किया जा रहा कीड़े की समस्या circumvents. इस पद्धति का भी एक बड़ा नमूना आकार वाले और शोधकर्ता नायाब परख चलाने और आवंटित समय समाप्त हो गया है एक बार कीड़े स्कोर करने की अनुमति देकर व्यावहारिक लाभ से पता चलता है.
Introduction
वार्ड पहले 1973 में 5 कीमोटैक्सिस परख विकसित की है, और उसके बाद से यह दूरगामी अनुप्रयोगों पड़ा है. तंत्रिका जीव विज्ञान कीमोटैक्सिस assays के एक किस्म का उपयोग करने से लाभान्वित किया है कि एक क्षेत्र है. घ्राण अनुकूलन, सीखने और स्मृति का एक सरल फार्म, सी में प्रदर्शित किया गया है chemotaxis assays 6 का उपयोग एलिगेंस. उन्होंने यह भी दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि सी. एलिगेंस इथेनॉल कीड़े के व्यवहार plasticity को दर्शाता है कि न केवल सहिष्णुता एक परिणाम विकसित कर सकते हैं, लेकिन वह भी कीड़े मनुष्यों 3 में शराब पर निर्भरता के अध्ययन में बहुत उपयोगी हो सकता है दिखाता है. Assays भी सी. की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए विकसित किया गया है एलिगेंस संघों chemoattractants और भोजन (OP50) 7 के बीच कीड़े द्वारा बनाई गई हैं कि दिखाकर लघु और दीर्घकालिक स्मृति की दुकान. इसके अतिरिक्त, सी. के बारे में वर्तमान में उपलब्ध व्यापक जानकारी दी एलिगेंस जीनोम, chemotaxiसी. का व्यवहार एलिगेंस म्यूटेशन 1,8 उत्प्रेरण द्वारा कई बार बदला गया है. इस तरह के सी. के विकास के रूप में कई रोमांचक इंजीनियरिंग संभावनाओं के लिए अनुमति देता है एक जैविक उपचार उपकरण के रूप में एलिगेंस. इस प्रकार, 1973 में कीमोटैक्सिस परख के प्रारंभिक विकास के बाद से, यह अक्सर बदल दिया है और विषयों की एक किस्म में रहस्यों को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है.
कुछ assays एक लक्ष्य की ओर कीड़े द्वारा उठाए गए विशिष्ट मार्ग की खोज के उद्देश्य से. इस तरह का प्रोटोटाइप परख वार्ड 5 से विकसित किया गया था. तीन कीड़े 15 मिनट के लिए पिघल अगर पर रखा गया था. उनके आंदोलनों वे प्लेट के केंद्र में एक attractant के लिए एक ढाल ऊपर प्लेट की परिधि से कूच के रूप में उन्हें छोड़ दिया छाप द्वारा पता लगाया गया. थाली पर सभी कीड़े प्रत्येक परीक्षण के अंत में क्लोरोफॉर्म का उपयोग करते हुए गिरफ्तार किया गया. इस विधि से एक वंशज attractant और नियंत्रण एक साथ थाली के बीच में एक कीड़ा रखामूल 2 से टी के बराबर और विपरीत दूरी.
पियर्स-शिमोमुरा एट अल. कीमोटैक्सिस 9 में शामिल आंदोलन की सही प्रकृति का निरीक्षण करने के लिए एक परख विकसित. व्यक्तिगत कीड़े attractant के स्रोत में बनी 9 सेमी पेट्री डिश attractant या एक रेडियल आकार ढाल के एक समान एकाग्रता युक्त या तो में रखा गया था. कीड़ा मान्यता प्राप्त है कि एक कंप्यूटर सॉफ्टवेयर प्रोग्राम मनाया व्यवहार रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एक खुर्दबीन से जुड़ी एक वीडियो कैमरा परख कीड़ा देखने के क्षेत्र में बने रहे यह सुनिश्चित करने के लिए दौड़ा के रूप में स्वतः पेट्री डिश समायोजित करने के लिए मंच के साथ संयोजन के रूप में काम किया. इस से, और अधिक विस्तृत जानकारी सी. द्वारा प्रदर्शित pirouettes के कारण के बारे में खोज की थी एलिगेंस.
यहाँ वर्णित एक के समान अन्य assays, परीक्षण यौगिकों के लिए कीड़े की एक बड़ी आबादी की प्रतिक्रिया का परीक्षण किया. दो चतुर्थ भाग chemotaxis assays किया गया हैविभिन्न न्यूरॉन्स, रिसेप्टर्स, और संकेत पारगमन अणु जब सी. निभाई भूमिकाओं कि पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया एलिगेंस विभिन्न यौगिकों 1 के संपर्क में था. 20-50 के बीच धोया कीड़े संवेदनाहारी, सोडियम azide (नेन 3) के साथ ध्रुवीय सिरों पर एक attractant और एक नियंत्रण के साथ प्लेट के केंद्र के पास रखा गया था. 60 मिनट के बाद, -1.0 से 1.0 तक मूल्यों के साथ एक chemotactic सूचकांक attractant के या नियंत्रण से चिपका रहे थे कि कितने कीड़े के बीच के अंतर के आधार पर उत्पन्न किया गया था. पहले परख सख्ती गैर चलता – फिरता कीड़े का मूल्यांकन करने में विफल रहा है, हालांकि एक समान chemotactic सूचकांक, इस लेख में बताया परख में इस्तेमाल किया गया था. यह परख तो आगे कीमोटैक्सिस पर न्यूरोनल पृथक के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए लागू किया गया था.
100-200 कीड़े चार quadrants 3 युक्त एक थाली के केंद्र में रखा गया है, जहां ऊपर उल्लिखित परख की एक और बदलाव किया गया था. निकटस्थ चतुर्भागों या तो या परीक्षण निहितपदार्थ नियंत्रण. पिछले assays में के रूप में, कीड़े बनाए जा रहा से पहले सोडियम azide की कार्रवाई से स्थिर किया गया. ऐसा ही एक विधि सी. की प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के तरीके के रूप में यहाँ वर्णित है विभिन्न यौगिकों के लिए एलिगेंस. हालांकि, नीचे विधि केवल स्थिर कीड़े से मोबाइल को अलग करने के लिए एक सीमा से दूरी पारित कर दिया है कि कीड़े के मूल्यांकन के अतिरिक्त लाभ है.
अन्य assays स्थिर कीड़े की अनदेखी के लिए इसी तरह के दिशा निर्देशों को शामिल किया है. Frøkjær-जेन्सेन एट अल. अस्थिर और पानी दोनों घुलनशील यौगिकों 10 परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एक बहुमुखी परख विकसित. एक पेट्री डिश चार quadrants में विभाजित किया गया था. ऊपर और नीचे चतुर्भागों सॉल्वैंट्स शामिल नहीं किया था. बाएं चतुर्थ भाग पानी निहित, और सही attractant के निहित. पानी में घुलनशील यौगिकों आगा पर सीधे रखा गया जबकि अस्थिर odorants जब परीक्षण, विश्लेष्य, उचित वृत्त का चतुर्थ भाग के ऊपर, डिश के ढक्कन पर रखा गया थाआर.
सी. के chemotactic प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए वर्तमान में अस्तित्व में तरीकों एलिगेंस लगातार उपयोग, दक्षता, और सटीकता के उनके आराम का अनुकूलन करने के लिए परिष्कृत किया जा रहा है. यहाँ वर्णित परख कीड़े की सबसे बड़ी संख्या (. अधिकतम प्रवाह: 250 कीड़े / प्लेट प्रति घंटा, ली एट अल 3 द्वारा प्रदर्शन throughput की तुलना में थोड़ा अधिक) का आकलन करने की क्षमता है तो, जबकि, इस विधि की असली ताकत है पहले assays के (1 टेबल) की विशेषताओं में से कई का संक्षिप्त परिणति.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chemotaxis, neuronal और सेलुलर तंत्र की एक जटिल सेट के द्वारा नियंत्रित हालांकि, आसानी से और निष्पक्ष कीमोटैक्सिस assays का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. Assays से सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए कुछ महत्व?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम लाइफ साइंसेज और इस काम के वित्तपोषण के लिए क्वींस विश्वविद्यालय में कला और विज्ञान संकाय धन्यवाद. साथ ही, हम आवश्यक अभिकर्मकों, उपकरण और तकनीकी सहायता प्रदान करने के लिए चिन गाया प्रयोगशाला धन्यवाद. हम भी चर्चा में उनके योगदान के लिए वह विशेष रूप से टोनी, QGEM 2011 धन्यवाद.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave | |||
| PicoFuge | Stratagene | 400552 | |
| Microscopes | Leica | ||
| Dissecting | Leica | ||
| P1000 Pipette | Gilson | ||
| P10 Pipette | Gilson | ||
| 0.5 M Sodium Azide | |||
| Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4] | |||
| Ethanol/Distilled Water | |||
| Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl) | |||
| Agar | Bio-Rad | 166-0600 | |
| NH4Cl | Amresco | CA97062-046 | |
| MOPS | VWR | CA12001-120 | |
| NH4OH | BDH | CABDH8641-2 | |
| 0.25% Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 |
References
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