C. elegans kemotaxianalys
Summary
En metod för att kvantitativt utvärdera den kemotaktiska responsen av<em> Caenorhabditis elegans</em> Beskrivs. En kemotaktiskt index (CI) användes som ett sätt att exakt utvärdera svaret av maskar för att vissa mål, och fungera som en plattform för jämförelse mellan stammar och föreningar av intresse.
Abstract
Många organismer använder chemotaxis att söka mat källor, undvika skadliga ämnen, och hitta kompisar. Caenorhabditis elegans har imponerande chemotaxis beteende.
Premissen bakom testa svaret av maskar till en luktämnen är att placera dem i ett område och observera rörelsen framkallade ett svar på ett doftämne. Även med de många tillgängliga analyser, optimera mask startplatsen i förhållande till både skydds-och provningsmetoder, samtidigt minimera interaktionen av maskar med varandra, samtidigt som en betydande urvalsstorleken fortfarande ett pågående arbete 1-10. Den metod som beskrivs här syftar till att hantera dessa frågor genom att modifiera analysen utvecklats av Bargmann et al. 1. En petriskål är indelad i fyra kvadranter, är två motsatta kvadranter märkta "Test" och två betecknas "Control". Narkos placeras i alla tester och platser kontroll. Maskarna är placerade i mitten av plattan med en circle märkta kring ursprunget för att säkerställa att icke-rörliga maskar kommer att ignoreras. Använda en fyra-kvadranten system snarare än en 2 eller två 1 eliminerar bias i rörelse maskar, eftersom de är på samma avstånd från test-och kontrollprover, oavsett vilken sida av ursprunget de började. Detta kringgår problemet med maskar tvingas att resa genom ett kluster av andra maskar att svara på ett doftämne, vilket kan försena maskar eller tvinga dem att ta en mer omväg, vilket gav en felaktig tolkning av den avsedda banan. Denna metod visar också praktiska fördelar genom att ha en större urvalsstorlek och låta forskare för att köra analysen obevakad och göra maskarna när den tilldelade tiden har gått ut.
Introduction
Ward utvecklades först kemotaxianalys 1973 5, och sedan dess har haft långtgående program. Neurobiologi är ett område som har dragit nytta av att använda en variation av kemotaxi-analyser. Olfactory anpassning, en enkel form av inlärning och minne, har visats i C. elegans använder chemotaxis analyser 6. De har också använts för att visa att C. elegans kan utveckla etanol tolerans-ett resultat som inte bara visar den beteendemässiga plasticitet av maskar, men det visar också att maskarna kan vara mycket användbar i studiet av alkoholberoende hos människor 3. Analyser har även utvecklats för att visa förmågan hos C. elegans för att lagra kort och lång sikt minne genom att visa att föreningar görs av maskar mellan kemoattraktanter och livsmedel (OP50) 7. Dessutom, med tanke på den omfattande information som för närvarande finns tillgänglig angående C. elegans genomet, den kemotaxis beteende C. elegans har ändrats flera gånger genom att inducera mutationer 1,8. Detta möjliggör många spännande tekniska möjligheter, t.ex. utvecklingen av C. elegans som en biologisk rening verktyg. Således, eftersom den inledande utvecklingen av kemotaxianalys 1973, har det ofta ändrats och används för att belysa mysterier i en mängd olika discipliner.
Vissa analyser som syftar till att upptäcka den specifika resväg som maskar mot ett mål. Den prototypiska analysen av detta slag har utvecklats av Ward 5. Tre maskar placerades på smält agar i 15 min. Deras rörelser spårades av avtryck de lämnade när de reste från plattans periferi uppförslut till ett lockmedel i mitten av plattan. Alla maskar på plattan greps med kloroform vid slutet av varje prov. En ättling av denna metod placeras en enda mask i mitten av plattan med attraktant och kontrollen ent lika och motsatta avstånd från ursprunget 2.
Pierce-Shimomura et al. utvecklat ett test för att observera exakt vilken typ av rörelse involverad i kemotaxis 9. Enskilda maskar placerades i 9 cm petriskålar antingen innehåller en likformig koncentration av lockbete eller ett radiellt formad gradient, som kulminerade i källan av lockmedel. Ett datorprogram program som kände igen masken användes för att registrera det observerade beteendet. En videokamera ansluten till ett mikroskop arbetade i samband med steget att justera petriskål automatiskt Som analysmetod sprang att säkerställa masken kvar i synfältet. Från denna, var mer detaljerad information upptäckt om orsaken till piruetter visas av C. elegans.
Andra analyser, mer liknar den som beskrivs här, testade svaret av en stor population av maskar till testföreningar. Två-kvadrant kemotaxi analyser haranvänds för att utforska de roller som olika nervceller, receptorer, och signalmolekyler transduktion spelas när C. elegans utsattes för olika föreningar 1. Mellan 20-50 tvättade maskar placerades nära mitten av plattan med ett lockmedel och en kontroll vid polära ändar tillsammans med bedövningsmedel, natriumazid (NaN3). Efter 60 minuter, var en kemotaktiskt index med värden från -1.0 till +1.0 genereras baserat på skillnaden mellan hur många maskar var fäst på lockmedel eller kontrollen. En liknande kemotaktiskt index användes i analysen redovisas i denna artikel, även om den tidigare analysen misslyckats med att strikt utvärdera icke-rörliga maskar. Denna analys sedan ytterligare appliceras testa effekterna av neuronal ablation på kemotaxi.
En annan variant av den tidigare nämnda analysen utfördes där 100-200 maskar placerades vid mitten av en platta innehållande fyra kvadranter 3. Intilliggande kvadranter innehöll antingen testet ellerstyra ämnet. Liksom i tidigare analyser, var maskar immobiliserades genom inverkan av natriumazid innan de scored. En liknande metod beskrivs här som ett sätt att utvärdera svaret av C. elegans till olika föreningar. Däremot har metoden nedan den extra fördelen att endast utvärdera maskar som har passerat en tröskel avståndet mellan mobil från orörliga maskar.
Andra analyser har införlivat liknande riktlinjer för att ignorera orörliga maskar. Frøkjær-Jensen et al. utvecklat en mångsidig analys som kan användas för att testa både flyktiga och vattenlösliga föreningar 10. En petriskål var uppdelad i fyra kvadranter. De övre och nedre kvadranter inte innehåller lösningsmedel. Den vänstra kvadranten innehöll vatten, och rätten innehöll lockmedel. Vid testning av flyktiga doftämnen, var analyten placeras på locket på skålen, över den riktiga kvadranten, medan vattenlösliga föreningar placerades direkt på agar.
De metoder som för närvarande existerar för att utvärdera det kemotaktiska svaret av C. elegans ständigt förfinas för att optimera sin användarvänlighet, effektivitet, och noggrannhet. Så, medan analysen beskrivs här har förmågan att bedöma det största antalet maskar (maximal genomströmning:. 250 maskar / timme per platta, något större än genomströmningen demonstreras av Lee et al 3), den verkliga styrkan i denna metod är att kortfattad kulmen på många av de attribut av tidigare analyser (tabell 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Chemotaxis, men styrs av en komplex uppsättning av neuronala och cellulära mekanismer, kan vara enkelt och objektivt kvantifieras med hjälp chemotaxis analyser. För att få bästa resultat från analyserna, måste vissa viktiga steg tas. För det första iscensättning maskarna är nödvändigt ger konsekventa experimentella resultat. Worms vid olika livsstadier beter sig annorlunda 13, så blandade skede maskar får skeva experimentella resultat. Det andra, säkerställer att allt E. coli tvätt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Life Sciences och fakulteten för Konst och vetenskap vid Queens University för att finansiera detta arbete. Vad bra, tackar vi Chin-Sang laboratorium för att tillhandahålla de nödvändiga reagenser, utrustning och teknisk support. Vi tackar också QGEM 2011, särskilt Tony han för hans bidrag till diskussionen.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave | |||
| PicoFuge | Stratagene | 400552 | |
| Microscopes | Leica | ||
| Dissecting | Leica | ||
| P1000 Pipette | Gilson | ||
| P10 Pipette | Gilson | ||
| 0.5 M Sodium Azide | |||
| Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4] | |||
| Ethanol/Distilled Water | |||
| Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl) | |||
| Agar | Bio-Rad | 166-0600 | |
| NH4Cl | Amresco | CA97062-046 | |
| MOPS | VWR | CA12001-120 | |
| NH4OH | BDH | CABDH8641-2 | |
| 0.25% Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 |
References
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-527 (1993).
- Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7, 729-742 (1991).
- Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. Ethanol preference in C. elegans. Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14, 803-812 (1995).
- Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
- Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans. Cell. 91, 161-169 (1997).
- Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).
- Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 3, e2467 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Sengupta, P., Bargmann, C. I. Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans. Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).
- Hart, A. C. Behavior. WormBook. , (1895).
