Isolasjon og kultur av mus Kortikale Astrocytes

Summary

Astrocytes har blitt anerkjent for å være allsidige celler som deltar i grunnleggende biologiske prosesser som er avgjørende for normal utvikling av hjernen og funksjon, og det sentrale nervesystemet reparasjon. Her presenterer vi en rask prosedyre for å få rene mus astrocyte kulturer å studere biologi denne store klassen av sentralnervesystemet celler.

Abstract

Astrocytes er et rikt celletype i hjernen hos pattedyr, men mye gjenstår å lære om deres molekylære og funksjonelle egenskaper. In vitro astrocyte cellekultur-systemer kan brukes til å studere de biologiske funksjonene til disse gliacellene i detalj. Denne videoen protokollen viser hvordan du kan få rene astrocytes av isolering og kultur av blandede kortikale celler av mus valper. Metoden er basert på fravær av levedyktige nevroner og utskillelse av astrocytes, oligodendrocytes og microglia, de tre viktigste glial cellepopulasjoner av det sentrale nervesystemet, i kultur. Representative bilder under de første dagene av kultur påvise en blandet cellepopulasjon og indikere endepunktet, når astrocytes blir sammenflytende og skal skilles fra microglia og oligodendrocytes. Videre viser vi renhet og astrocytic morfologi dyrkede astrocytes bruker immuncytokjemisk stainings for godt etablert ognylig beskrevet astrocyte markører. Denne kulturen system lett kan brukes til å oppnå rene mus astrocytes og astrocyte klimaanlegg medium for å studere ulike aspekter av astrocyte biologi.

Introduction

Astrocytes er en meget rikelig celletype i sentralnervesystemet (CNS). Forholdet mellom astrocytes til nevroner er 01:03 i cortex av mus og rotter, mens det er 1,4 astrocytes per nervecelle i den menneskelige cortex ^en. Interessen for astrocyte funksjon har økt dramatisk de siste årene. En viktig funksjon av astrocytes er deres rolle i å gi strukturell og metabolsk støtte til nevroner ^2,3. Nyoppdagede roller for astrocytes dekker et bredt spekter av funksjoner. Disse inkluderer guiding migrering av utviklingsland axoner og visse neuroblasts under utvikling ^4-6, funksjoner i synaptisk transmisjon, synapse styrke og informasjonsbehandling ved nevrale kretser ^7-9, roller i blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​formasjon ¹⁰ og integritet ^11-13 og regulering av den cerebrovaskulære tonen ^14. En annen viktig funksjon i astrocytes er deres respons på skade. Under patologiske tilstander astrocytes bli reaktive og ytterligere oppregulere uttrykk for den mellomliggende filament glial fibrillary surt protein (GFAP) og hemmende ekstracellulære matrix (ECM) proteiner ^15,16. Avgrense reaktive astrocytes skaden området fra friskt vev ved å danne en glial arr, som består hovedsakelig av astrocyte skilles ECM proteiner av chondroitin sulfat proteoglykan (CSPG) familie, de viktigste faktorene som hemmer aksonal regenerasjon etter CNS skade ^15-17.

Astrocytes stammer fra radial glial (RG) celler i slutten embryogenese og tidlig postnatal liv. Etter astrocyte spesifikasjonen har skjedd, astrocyte forløpere migrere til sine endelige posisjoner, hvor de begynner prosessen med terminal differensiering. In vivo, astrocytes synes å være moden tre til fire uker etter fødselen som indikert av sine typiske morfologi ^18,19. En undergruppe av RG celler konvertere til subventricular sone astrocytes (type B-celler). Both, RG og type B-celler fungere som astrocyte-lignende nevrale stamceller (NSCs) under utvikling og i den voksne, henholdsvis. Som astrocytes, RG og type B-celler også uttrykke astrocyte-spesifikke glutamat transporter (GLAST), hjernen lipid-bindende protein (BLBP), og GFAP, noe som indikerer at disse markørene kan ikke bare brukes til å spesifikt merke voksne astrocytes. I motsetning til voksne parenkymatøs astrocytes, som ikke deler i sunn hjerne, RG og type B celler utstillingen stamcelle potensial slik som evnen til å selv fornye. Feilregulering astrocytes har blitt implisert i en rekke patologier, inkludert Alzheimers sykdom ^20,21, Huntingtons sykdom ^22, Parkinsons sykdom ^23, Retts syndrom ²⁴ og Alexander sykdom ^25. Videre astrocytes reagere på alle fornærmelser i CNS, noe som fører til aktivering og astrocyte astrocytic glial arrdannelse ^16,26. Den astrocytic glial arr som danner følgende hjernen trAUMA eller ryggmargsskade er tenkt å være den viktigste barrieren hindrer neuronal regenerasjon ^15.

Å utvikle pålitelige metoder for å isolere og vedlikeholde rensede populasjoner av celler har vært avgjørende for vår forståelse av nervesystemet. Pionerarbeid av McCarthy og de ​​Vellis gjør etterforskere til dato for å forberede nesten rene kulturer av astrocytes fra neonatal rotte vev ^27. Mye har blitt lært om astrocyte biologi ved hjelp av denne metoden, som er presentert her i en litt modifisert form for isolering mus kortikale astrocytes. Supplerer in vivo studier, astrocytes samt betinget medium oppnådd ved hjelp av den beskrevne in vitro kultur, er verdifulle verktøy for å ytterligere få innsikt i astrocyte funksjoner.

Protocol

1. Isolering og Plating av Mixed Kortikale Cells Blandet kortikal celleisolasjon for astrocyte kulturer kan utføres ved hjelp P1 til P4 mus valper. For å oppnå riktig astrocyte tetthet er det nødvendig å bruke fire mus pup cortices pr T75 vevskultur kolbe. Derfor er volumene i følgende protokoll beregnet for en celle forberedelse på 4 mus unger. Før disseksjon prosedyren, prewarm 30 ml astrocyte dyrkningsmedier (DMEM, høy glukose + 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum…

Representative Results

Ved isolering av den komplette mus hjernen (figur 1A), lillehjernen og olfactory pærer må fjernes (figur 1B). De cortices skrelles av musen hjernestammen (figur 1C) og hjernehinnene den enkelte cortex (figur 1D ') er omhyggelig fjernet (figur 1E). Hjernehinnene er åpenbart av meningeal arterien systemet og ufullstendige fjerning resulterer i forurensning av det endelige astrocyte kulturen ved meningeal celler og fibroblaster. </p…

Discussion

Metoden beskrevet her er basert på den astrocyte kultur forberedelse fra gnagere neonatal hjerner, opprinnelig beskrevet av McCarthy og de ​​Vellis i 1980 ^27. Den modifiserte metode for isolering og kultur av kortikale astrocytes fra postnatal P1 til P4 mus hjernen som presenteres her er rask, avkastning rene primære astrocytes og er reproduserbar. Denne teknikken kan enkelt overføres til isolere astrocytes fra andre arter, for eksempel fra rotte eller gris og fra andre hjerneregioner som ryggmargen. M…

Materials

Name of working solution	Company	Catalogue number	Final concentration
			Astrocyte culture media
DMEM, high glucose	Life Technologies	31966-021
FBS, heat-inactivated	Life Technologies	10082-147	Final Concentration: 10%
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122	Final Concentration: 1%
			Solution for brain tissue digestion
HBSS	Life Technologies	14170-088
2.5% Trypsin	Life Technologies	15090-046	Final Concentration: 0.25%
			Other
70% (vol/vol) ethanol	Roth	9065.2
Poly-D-Lysine	Millipore	A-003-E	50 μg/ml
Water	PAA	S15-012	cell culture grade
PBS	PAA	H15-002	cell culture grade
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-062
0.45 μm Sterile filter	Sartorius	16555
3.5 cm petri dish	BD Falcon	353001
15 ml Falcon tube	BD Falcon	352096
50 ml Falcon tube	BD Falcon	352070
75 cm2 Tissue culture flask	BD Falcon	353136
Forceps, fine	Dumont	2-1032; 2-1033	# 3c; # 5
Forceps, flat tip	KLS Martin	12-120-11
13 cm surgical scissors	Aesculap	BC-140-R
Stereomicroscope	Leica		MZ7.5
Stereomicroscope + Camera	Leica		MZ16F; DFC320
Microscope + Camera	Zeiss; Canon		Primo Vert; PowerShot A650 IS
Centrifuge	Eppendorf	5805000.017	Centrifuge5804R
Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE 4450-1CE	MaxQ 4450
Water bath	Julabo		SW20; 37 °C