Summary
トランスジェニックマウスまたはウイルスベクターは、肺内のタンパク質の発現を増加させるために使用されてきた。しかしながら、これらの技術は、技術的に困難な、時間がかかり、その結果を混乱させることができオフターゲット作用を有する。当社タンパク質トランスフェクションプロトコルは、脂質ベースのトランスフェクション試薬と一様に肺細胞に活性なタンパク質を提供する超microsprayerを使用しています。
Abstract
増やすタンパク質の発現は、より良いキー生物学的プロセス1を調節するそのタンパク質の機能的役割を理解するために研究者を可能にします。肺では、これは、トランスジェニックマウス2,3又は増加した遺伝子発現4を介してタンパク質レベルを上昇させるウイルスまたは非ウイルスベクターを利用する遺伝的アプローチを介して典型的に達成された。トランスジェニックマウスを生成するためにコストと時間がかかり、導入遺伝子又は慢性の遺伝子発現のランダム挿入は、正常な肺の発達を変更し、従って、モデル5の有用性を制限することができる。条件式を生成するために使用される慢性の遺伝子発現6、逆テトラサイクリン制御型トランス（rtTA）マウスに関連する問題AVERT条件トランスジェニックながら、自発的なエアスペースの拡大7を開発する。トランスジェニックと同様に、ウイルス性および非ウイルスベクターの使用は、8高価であり、用量dのを誘発することができ結果9を混乱し、式10を妨げるependent炎症反応。また、反復投与の有効性は、ベクトル11,12に強化された免疫応答によって制限されます。研究者は少なく炎症を誘発し、肺13内に長い式を持つアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターの開発を進めています。
β-ガラクトシダーゼを用いて、迅速かつ効果的に直接タンパク質トランスフェクション技術を用いて肺内のタンパク質の発現を増加させるための方法を提案する。このプロトコルは、肺組織自体への浸透を可能にする脂質ベースのトランスフェクション試薬20μlの（プロジェクト、ピアースバイオ）を用いて精製タンパク質の一定量を混合する。リポソームタンパク質混合物を次いmicrosprayer（ペン世紀、フィラデルフィア、PA）を用いて気管を介してマウスの肺に注入される。 microsprayerは、肺全体に液体エアロゾルの微プルームを生成します。技術を用いて私たちは、気道やマウス14の肺胞を通して注入されたタンパク質の均一な付着を実証している。脂質トランスフェクション手法は、効果を達成するために少量のタンパク質の使用を可能にする。これは、そうしないと高タンパク投与によって引き起こされる炎症反応を制限します。実際、この手法使って、我々はかなり肺胞細胞性15に影響を与えることなく、肺のPP2A活性を高めることができたことを発表した。チャレンジ後24時間を取られ、肺胞細胞充実性は、コントロール（;グループ当たりN = 6 27±4制御対31±5アルブミントランスフェクションされた）に匹敵するものであった。また、トランスジェニックモデルで発生する可能性があり、肺の発達変更やアーキテクチャの変更を誘発することなく、タンパク質レベルを増加させます。しかし、反復投与の必要性は、タンパク質発現の長期的増加する効果を調べる研究のためにこの技術はあまり好ましく行うことができる。これはTRU特にだろう短い半減期を有するタンパク質の電子。
Protocol
1。タンパク質トランスフェクション試薬の調製
- ドライフィルムを含む試験管にメタノールやクロロホルムを250μlを加えることによりプロジェクト試薬を溶解する。
- トップスピードで10〜20秒間ボルテックスする。
- 別個のマイクロ遠心チューブにプロジェクト試薬のピペットを20μl。
- 室温で6時間以上は、層流フードの下プロジェクト試薬を含有するマイクロチューブを配置することによって、溶媒を蒸発する。それは完全に乾燥していなければならない。また、真空デシケーターを用いたプロジェクト試薬を乾燥させます。
- -20℃でチューブを保管彼らは、この温度で1年間に適しています。
2。プロジェクト試薬にプロテインを追加する
- PBSのピペットを50μl、乾燥プロジェクトのトランスフェクション試薬を20μlを含むチューブに、目的のタンパク質の2.0アンピシリンを含む。
- タンパク質を追加した後、低速fでボルテックスして、ソリューションをミックスまたは3-5秒室温で30分間インキュベートした。
3。プロテインの気管内投与
- ケタミン/キシラジン（100 mg / kg体重および10 mg / kg体重）の腹腔内注射によってマウスを麻酔。
- 鎮静が達成された後、マウスを、特別に設計されたプラットフォーム（ 図1）を使用して上顎から吊り下げられている。
- 喉頭鏡として鉗子やクリップを使用して、中咽頭（ 図2）カテーテルを導入することができるように開放される。声帯は、マウスの気管に対して光源を配置することによって可視化される。
- タンパク質/プロジェクト試薬混合物（50μl）をペンセンチュリーMicrosprayerを使って気管を介して注入されています。
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Representative Results
私たちの技術の有効性を実証するために、我々はプロジェクトのトランスフェクション試薬20μlのが含まれていたPBS50μlの中に溶解させたマウスの2μgのアルブミン（Sigma）でマウスの気管に注入するmicrosprayer（ペンセンチュリー）を使用していました。アルブミン処置したマウスは、β-ガラクトシダーゼタンパク質2μgの（ピアースバイオ）と同一の方法で処理したマウスと比較した。二十四時間後、マウスを安楽死させ、肺を組織学的分析のために処理した。 β-ガラクトシダーゼについての免疫組織化学は、アルブミンおよびβ-ガラクトシダーゼ処置したマウスからのホルマリン固定した肺組織切片上で実施した。タンパク質トランスフェクション後24時間であっても、我々は、β-ガラクトシダーゼで処理したマウスではなく、アルブミン投与したマウス（ 図3Aおよび3B）の気道内に強い染色（大矢印）を検出しました。
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図1。気管内注入のためにマウスを位置決めするために、木材プラットフォームは、その基部16から45°の角度で傾斜を有する構築した。マウスの上部には、二つの金属フックに取り付けられた金属線によりそれらの切歯から懸架されているランプ。舌が優しく鉗子とペーパークリップ喉頭鏡を気道を開くために使用されて再配置されます
図2。首に光源を置いた後、喉頭は気管内注入16可視化することができる。
図3。 β-ガラクトシダーゼimmunostainsは2μgので気管内注射したマウスから4μmの肺切片で行ったアルブミン（）またはβ-ガラクトシダーゼ（B）。矢印は、気道内のβ-ガラクトシダーゼ染色を示す。画像は40Xの倍率である。スケールバー=100μmである。
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Discussion
他の方法に比べて、この技術の利点は、肺組織自体の中のタンパク質レベルおよび活性の増加を生じることである。また、それだけで気道内に滞在するのではなく、肺の最も遠位の地域に浸透。私たちも、生理食塩水15で気道を洗浄助後に注入液の増加したタンパク質の活性を測定した。組織アクティビティ分析は、タンパク質が細胞に入るとき、ちょうどマウスの空気空間内に残っていないことを示している。これは、さらに、マウスの肺胞と気道（ 図3）内に注入された私たちのタンパク質の拡散染色を示す免疫組織化学によって確認された。重要なことに、このプロトコルは、肺の炎症またはプロテアーゼ発現を誘発しない。したがって、発生しないすべての変更は、投与されたタンパク質の作用に起因することができます。炎症反応の欠如は調馬索上の効果を調べるために反復注射の使用を可能にする時刻rの期間。
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Disclosures
著者らは、開示する利害の衝突を持っていません。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所（7R01HL098528-03）とFAMRIの臨床イノベーター賞によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
| Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
| Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |
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