4D जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन एकत्रीकरण की इमेजिंग

Summary

सेलुलर व्यवहार्यता प्रोटीन misfolding के समय और कुशल प्रबंधन पर निर्भर करता है. Refolding, गिरावट, या inclusions में ज़ब्ती: यहाँ हम एक misfolded प्रोटीन के विभिन्न संभावित भाग्य visualizing के लिए एक विधि का वर्णन है. हम एक तह सेंसर के उपयोग के प्रदर्शन, Ubc9^टीएस निगरानी Proteostasis और एकत्रीकरण रहते 4D माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं में गुणवत्ता नियंत्रण के लिए.

Abstract

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability¹. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer’s, Parkinson’s, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components², and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.

The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment¹. The folding health, or “proteostasis,” of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system^3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state¹, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system⁵, or direct them to protective aggregation inclusions^6-9.

In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments^8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 – model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.

Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.

We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein^10-12 (Ubc9^ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9^ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 °C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9^ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Protocol

1. खमीर तैयारी एक प्लाज्मिड एक कैसेट GAL1 GFP-Y68L (UBC9 टीएस) ले जाने के साथ बदलना खमीर उपभेदों. सिंथेटिक 24 घंटे के लिए 2% raffinose वाले मीडिया में खमीर बढ़ो और 16 घंटा या / ओ एन के लिए वापस 2% galactose वाले मीडिया पतला 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं, जबकि 200 rpm पर मिलाते हुए. निम्नलिखित सुबह, आयुध डिपो 600 = 0.2 क्वेरी तनाव पतला. 30 डिग्री सेल्सियस (200 rpm) में 4-6 घंटे के लिए शेक जब तक संस्कृति आयुध डिपो 600 = 0.8-1.0 तक पहुँचता है. अभिव्यक्ति (इतनी के रूप में केवल GFP-Ubc9 ts की पहले से ही अनुवाद और जोड़ पूल की निगरानी), सिंथेटिक 2% (एसडी) ग्लूकोज इमेजिंग के लिए पहले 30 मिनट के साथ पूरक मीडिया के लिए परिवर्तन मीडिया को दबाने के लिए. उपचार – गर्मी झटका 37 पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं ° C misfolding प्रेरित या लगातार खुर्दबीन गर्मी झटका परिस्थितियों में प्रोटीन एकत्रीकरण का पालन इनक्यूबेटर में. नोट – यदि आप आरटी, पूर्व गर्मी के लिए ऊपर किसी भी तापमान पर माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहे हैं2 घंटा खुर्दबीन और उद्देश्यों के शरीर (देखें नीचे) के साथ तापमान संतुलन में लाना के बारे में आर. 2. प्लेट \ स्लाइड तैयारी उपयुक्त थाली चुनें. मुख्य विचार इमेजिंग अधिग्रहण के दौरान ध्यान बनाए रखने की क्षमता है. निम्नलिखित बातों 4D इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है और 2 डी समय खामियों या 3 डी इमेजिंग के लिए नहीं कर रहे हैं. एकाधिक कुओं थाली – अलग कुओं के नीचे समरूप नहीं होना चाहिए (कुओं यानी अलग उद्देश्य के लिए रिश्तेदार ऊंचाई पर हो जाएगा) हो सकता है. यह मुश्किल xy अंक और समय अंक में ध्यान बनाए रखने के लिए, autofocusing तकनीक का इस्तेमाल किया जा रहा है की परवाह किए बिना कर देगा. स्लाइड सामग्री: गिलास बनाम प्लास्टिक. ग्लास तली स्लाइड कुओं के बीच अधिक z-समरूप हैं, लेकिन अधिक महंगे हैं. प्लेट नीचे की मोटाई: हम आम तौर पर coverslip नीचे प्लेटों 1.5 सूचकांक का उपयोग करने के लिए, लेकिन 1 सूचकांक भी स्वीकार्य उद्देश्य पर निर्भर करता है. Covथाली की एर नीचे \ CONA (0.25 मिलीग्राम / एमएल) के साथ 10 मिनट के लिए स्लाइड. CONA स्लाइड है, जो समय के साथ एक एकल कक्ष के बाद के लिए सक्षम बनाता है कोशिकाओं पालन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. CONA निकालें और एक रासायनिक हुड में ताकि अतिरिक्त CONA लुप्त हो जाना जाएगा स्लाइड सेते हैं. प्लेट खमीर नमूना का अच्छी तरह से ConAed में 200 (600 = आयुध डिपो 0.5) μl. 15 मिनट के लिए सेते हैं, के रूप में सक्षम करने के लिए कोशिकाओं थाली की सतह के लिए छड़ी. मध्यम निकालें, और नए माध्यम के साथ तीन बार धोने के लिए कोशिकाओं की एक परत हो. नोट: अगर एक लंबे समय चूक की योजना बनाई है, बीज कोशिकाओं कम इतना है कि नए कलियों को भरने नहीं है और ब्याज के क्षेत्र बाधित होगा. 3. माइक्रोस्कोप तैयारी हम कुछ गैर मानक संशोधनों के साथ एक Nikon A1Rsi confocal खुर्दबीन का उपयोग करें. खमीर इमेजिंग के लिए हम 4 लेज़रों (457-514 एनएम, 65 मेगावाट आर्गन आयन लेजर, 561 एनएम, 50 मेगावाट नीलम लेजर, 405 एनएम, 50 मेगावाट CUBE लेजर और 640 एनएम, 40 मेगावाट CUBE लेजर) का उपयोग करते हैं, और अप करने के 4 के साथ सुसज्जित PMTsफिल्टर. हमारे इमेजिंग के अधिकांश EGFP के लिए एक हरे रंग फिल्टर सेट और mCherry और tdTomato के लिए एक लाल फिल्टर सेट के साथ किया जाता है. GFP और mCherry के साथ लगभग कोई bleedthrough है, इसलिए हम अक्सर एक साथ स्कैनिंग का उपयोग करें. हालांकि, लाइन स्कैनिंग के लिए bleedthrough रोकने जब यह होती है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारी confocal भी एक PInano Piezo (एमसीएल) मंच है, जो 3 Z में मिसे कदम बनाने, 2-3 प्रति सेकंड z के ढेर (30-50 वर्गों) सक्षम कर सकते हैं के साथ सुसज्जित है. एक GALVANO स्कैनर और एक गुंजयमान स्कैनर – प्रणाली भी एक वर्णक्रमीय डिटेक्टर, बिल्कुल सही फोकस (लेजर ऑफसेट), और दो स्कैनर. उपयुक्त उद्देश्य चुनें. मुख्य विचार: जल / उद्देश्य / तेल एयर: मुख्य विचार नमूने के माध्यम बनाम इमेजिंग माध्यम के अपवर्तक सूचकांक है. तेल उद्देश्य फायदे: तेल उद्देश्य उच्च संख्यात्मक apertures (तेल टूट पानी की तुलना में अधिक प्रकाश, और इसलिए अधिक photons उद्देश्य के लिए वापस जाना) हो सकता है. तेल उद्देश्यों को हो सकता है1.49 एनए, 1.27 पानी के लिए की तुलना में. (हालांकि, यह वास्तव में संकल्प में एक बड़ा फर्क नहीं है). तेल की अपवर्तक सूचकांक कांच के अपवर्तक सूचकांक से मेल खाता है, इसलिए कोई फोटॉनों नमूना से जा रहा खो रहे हैं, कांच के माध्यम से उद्देश्य के लिए है. (नोट – एक विसर्जन तेल है कि एक अपवर्तक सूचकांक है कि अपने उद्देश्य और अपने coverslip के लिए उपयुक्त है चुना है). तेल परेशानी मुक्त लंबे समय चूकों के लिए सक्षम बनाता है के बाद से यह लुप्त हो जाना नहीं है. तेल उद्देश्य नुकसान: तेजी उच्च तेल के उद्देश्यों की उच्च एनए के द्वारा सक्षम संकल्प degrades अगर प्रकाश एक जलीय माध्यम (जैसे एक सेल) के माध्यम से यात्रा की है. छवियाँ आमतौर पर अधिक गोलाकार aberrations है और एक "बाहर फैला" 3 डी में प्रभाव. तेल चिपचिपा, गंदा, और उद्देश्यों के लिए एक खतरा है. जल उद्देश्य लाभ सेल ही जलीय है, इसलिए वहाँ Z में कम विकृतियों, एकएन डी संकल्प एक जलीय नमूना में उच्च गहरी बनी हुई है. स्वच्छ और उपयोगकर्ता के अनुकूल. जल नुकसान उद्देश्य: evaporates जल्दी है, इसलिए विशेष पानी उद्देश्य के लिए लगातार पंप किया जा रहा है की व्यवस्था के बिना लंबी फिल्मों के लिए उपयुक्त नहीं है. एयर उद्देश्य फायदे: 1. कोई सामग्री / evaporates कई बिंदु अधिग्रहण या एक लंबी फिल्म के दौरान खो दिया है. 2. स्वच्छ और उपयोगकर्ता के अनुकूल. नुकसान: कम संकल्प और कम संकेत संवेदनशीलता. कक्ष और इनक्यूबेटर तापमान: बदलते तापमान बात गुणों को प्रभावित करता है, और नाजुक प्रणालियों में ध्यान केंद्रित परिवर्तन. तापमान अधिग्रहण के लिए अंक चुनने से पहले समायोजित किया जाना चाहिए. अधिग्रहण के दौरान तापमान बदलने इमेजिंग बाधित और ध्यान के नुकसान में परिणाम देगा. हम हमारे खुर्दबीन प्रणाली इमेजिंग से पहले वांछित तापमान पर 2 घंटे के लिए संतुलन में लाना. सुधार कॉलर: कई उद्देश्यों एक सुधार को सक्षम करने की अंगूठी के साथ आते हैंउद्देश्य एक दिया कवर पर्ची मोटाई के लिए समायोजित किया जा. हम सुधार कॉलर समायोजन जबकि फ्लोरोसेंट मोती का उपयोग करने के लिए बात फैल समारोह कल्पना की सलाह देते हैं. यह हर नमूना के लिए सही सेटिंग्स सुनिश्चित करेगा. स्थिर नमूना धारकों: हम पाते हैं कि सबसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नमूना धारकों माइक्रोस्कोप के सबसे कमजोर हिस्सा हैं. वे अक्सर wobbly और सीधे नहीं कर रहे हैं. यह उच्च संकल्प, बहु बिंदु 4D इमेजिंग के लिए एक आपदा है. हम अपने ही नमूना धारकों कि सीधे डिजाइन और मंच पर कसकर फिट. उन्होंने यह भी नीचे bolted किया जा सकता है जब जरूरत थी. अधिग्रहण बहु बिंदु: हमारे इमेजिंग प्रणाली Nikon 'परफेक्ट ध्यान "प्रणाली है, जो मूल रूप से एक लेजर आधारित तंत्र है ऑटो फोकस के साथ सुसज्जित है. हालांकि, autofocusing जरूरी 4D इमेजिंग के साथ आवश्यक नहीं है, खासकर अगर प्रणाली एक बहुत बहाव नहीं करता है. 4. इमेजिंग प्रणाली पर बारी: पराबैंगनीकिरण, चरण, नियंत्रक, कैमरा और compuआतंकवाद सॉफ्टवेयर. चरण धारक पर रखें प्लेट, ठीक से सुरक्षित और स्थिर है. आंख बंदरगाह का उपयोग करने के लिए स्थान और खमीर के उन्मुखीकरण का निर्धारण करने के लिए. Brightfield का प्रयोग, आकार और बनावट के अनुसार सेल के स्वास्थ्य और व्यवहार्यता का आकलन. प्रासंगिक fluorophore (GFP के लिए जैसे FITC फिल्टर) अनुसार epifluorescent प्रकाश पर बारी, और phenotype जो अपने अनुसंधान के अधीन है प्रदर्शित कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया है. कक्ष है जो एक से अधिक तरंग में अत्यधिक फ्लोरोसेंट हैं मर चुका है और इसलिए autofluorescent हो सकता है. हम एक tdTomato fluorophore SV40 एनएलएस संकेत (एनएलएस TFP) से इनकार के साथ नाभिक कल्पना. TFP दो बार GFP के आकार के है, और इसलिए नाभिक की प्रसार सीमा से ऊपर है, इसलिए यह एक परमाणु मार्कर के रूप में बहुत अच्छी तरह से काम करता है. हम भी GFP (488 एनएम) के रूप में एक हरे रंग की एक साथ लेजर के साथ TFP उत्तेजित कर सकते हैं, लेकिन वर्णक्रमीय समाधान के लिए दो अलग – अलग PMTs में हरे और लाल उत्सर्जन इकट्ठा. निम्नलिखित सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए शोर को कमoversaturation और: लेजर शक्ति और photobleaching बनाम छवि की चमक phototoxicity माना जाना चाहिए. लाभ: कैमरा संवेदनशीलता को प्रभावित करता है, इस प्रकार शोर अनुपात करने के लिए सिग्नल. Pinhole व्यास – छोटी तरंग दैर्ध्य के साथ लेजर के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए. pinhole व्यास निर्धारित करता है ऑप्टिकल अनुभाग की मोटाई (ऊँचाई) imaged. इस प्रकार, pinhole खोलने अधिक प्रकाश में अधिक photons चलो इकट्ठा, लेकिन Z (कम confocality) में संकल्प में कमी होगी. उपयोगी टिप्स: यदि विभिन्न fluorophores सर्वांगसम तरंग दैर्ध्य फेंकना, वर्णक्रमीय वेक्षक सुविधा है जो आभासी फिल्टर के चुनाव के लिए सक्षम बनाता का उपयोग करें. ध्यान रखें कि वर्णक्रमीय डिटेक्टरों कम नियमित PMTs की तुलना में अधिक संवेदनशील हैं. यदि विभिन्न fluorophores ही लेजर से उत्साहित हैं, लाइन स्कैनिंग सुविधा का उपयोग करें. GALVANO स्कैनर अधिक संवेदनशीलता के लिए सक्षम बनाता है, लेकिन photobleaching के लिए एक उच्च जोखिम है. एक गुंजयमान स्कैनर एक तेजी से सक्षम बनाता हैcquisition, इस प्रकार photobleaching के लिए जोखिम कम है, लेकिन कम संवेदनशील है. 2 और 16 के बीच छवियों औसत, यह शोर अनुपात करने के लिए संकेत बढ़ाता है, लेकिन अधिग्रहण धीमी है और निश्चित रूप से, बनाता है, नमूना के लेजर के लिए जोखिम शामिल है. की अवधि अधिग्रहण जैविक सवाल (जैसे JUNQ और आइपॉड गठन ~ 2 घंटा लेता है) पर निर्भर करता है. हम समय चूक 3 डी में 30 घंटा लिए गुंजयमान स्कैनर के साथ खमीर imaged है. समय चूक अंतराल छोटे अंतराल एक और अधिक सुसंगत फिल्म बना सकते हैं लेकिन तस्वीर विरंजन और इसलिए संकेत के नुकसान का कारण हो सकता है.

Representative Results

चित्रा 1. आदर्श: misfolded प्रोटीन का उप सेलुलर compartmentalization अलग कार्यों के साथ अलग – अलग डिब्बों में गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र misfolded प्रोटीन का निर्देशन: घुलनशील प्रोटीन, गिरावट के लिए लक्षित, पाली ubiquitination गुजरना और जू uclear XTA – एन क्यू uality नियंत्रण डिब्बे (JUNQ भेजा जाता है ). सुरक्षात्मक ज़ब्ती के लिए अघुलनशील प्रोटीन कि ubiquitinated नहीं किया जा सकता है मैं nsoluble otein पीआर डी (आइपॉड) eposit, रिक्तिका करने के लिए निकट, के लिए भेजा जाता है, जहां वे सक्रिय एकत्रीकरण से गुजरना. es.jpg "src =" / files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg / "> चित्रा 2. मॉडलिंग GFP-Ubc9 टीएस के साथ प्रोटीन misfolding. सामान्य परिस्थितियों के अंतर्गत, GFP-Ubc9 टीएस (हरा) natively, मुड़ा है और diffusely नाभिक और cytosol में स्थानीयकृत. नाभिक एनएलएस TFP (लाल) द्वारा लेबल है. Ubc9 टीएस की अभिव्यक्ति सभी प्रयोगों में इमेजिंग से पहले 2% ग्लूकोज के अलावा द्वारा बंद किया गया था. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . तापमान 37 के लिए बदलाव होने पर डिग्री सेल्सियस, GFP-Ubc9 टीएस (हरा) और misfolded साइटोसोलिक तनाव foci रूपों. नाभिक एनएलएस TFP (लाल) द्वारा लेबल है. GFP-thermally denaturated Ubc9 टीएस गर्मी सदमे से 23 डिग्री सेल्सियस, वसूली पर पदावनत है, के रूप में कम प्रतिदीप्ति स्तर से संकेत. 80 MG132 मम, GFP-U के साथ तापमान 37 डिग्री सेल्सियस और एंटीबॉडी निषेध बदलाव पर bc9 ts misfolded और JUNQ और आइपॉड inclusions में संसाधित. नाभिक एनएलएस TFP (लाल) द्वारा लेबल है. तापमान 37 के लिए बदलाव पर ° C और ubiquitination निषेध, GFP-Ubc9 टीएस misfolded है और आइपॉड शामिल किए जाने में संसाधित. नाभिक एनएलएस TFP (लाल) द्वारा लेबल है. Ubiquitin Protease 4 (Ubp4) लिए Ubc9 टीएस ubiquitination ब्लॉक overexpressed है. चित्रा 3. के समय तापमान 37 के लिए बदलाव JUNQ और आइपॉड गठन पर चूक डिग्री सेल्सियस और 80 MG132 मिमी के साथ एंटीबॉडी निषेध, GFP-Ubc9 टीएस तनाव foci JUNQ और आइपॉड inclusions में कार्रवाई कर रहे हैं. नाभिक एनएलएस TFP (लाल) द्वारा लेबल है. 3 डी छवियों 4 मिनट के अंतराल पर हासिल किया गया. (1 मूवी देखें).com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg "लक्ष्य ="> _blank "बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के बारे में हमारी intuitions बेंच शीर्ष प्रयोगों में जो reactants और उत्पादों की एक अच्छी तरह से मिश्रित समाधान एक बीकर में संतुलन तक पहुँचने की अनुमति दी है से निकाले जाते हैं. इस तरह के एक सेटिंग में, किसी दिए गए रासायनिक प्रजातियों की एकाग्रता एक ही नंबर है, जो एक macroscopic मात्रा में अणुओं की एक दाढ़ मात्रा के अनुपात के रूप में व्यक्त किया जा सकता है. पश्चिमी blots, centrifugations, और spectrophotometric माप कोशिकाओं की पूरी आबादी के homogenates से निष्कर्षों पर बाहर किया जाता है: क्या हम प्रोटीन संरचना और कार्य के बारे में पता है की ज्यादातर तरीकों कि क्लासिक, थोक प्रतिक्रिया तस्वीर को प्रतिबिंबित का उपयोग करने से निकला है.

प्रौद्योगिकी हम आवर्धन के तहत कोशिकाओं में देखने के लिए उपयोग के रूप में कई गुना से सुधार है, यह कभी स्पष्ट है कि जिन स्थितियों में सबसे जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं vivo में जगह लेने के केवल थोड़ी सी क्लासिक बेंच शीर्ष परिदृश्य के उन लोगों के लिए सादृश्य भालू हो जाता है. न केवल cel के इंटीरियरला घनी पर्यावरण पैक, जो भीड़ प्रभाव काफी हद तक विभिन्न reactants की गतिविधियों को बदलने के लिए, यह भी काफी अच्छी तरह से मिश्रित के विपरीत है. इन विट्रो में और जटिल macromolecular प्रतिक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के vivo क्षमता के बीच लगातार असमानता के लिए यह खातों.

कहीं इन विट्रो जैव रासायनिक vivo तह, misfolding, और प्रोटीन का एकत्रीकरण में संबंधित प्रश्नों के रूप में गुमराह करने के लिए प्रवण प्रयोगों में शास्त्रीय से stemming intuitions हैं. जबकि थोक प्रतिक्रियाओं में प्रोटीन रसायन शास्त्र के अध्ययन एक सरल हाँ या कोई सवाल के रूप में एक भी प्रोटीन के लिए तह के मुद्दे का इलाज कर सकते हैं, किसी भी तरह से एक जीवित कोशिका में बड़े अणुओं की पूरी आबादी की गतिशीलता को ट्रैक करने की कोशिश संभव के पूरे वितरण के लिए संवेदनशील होना चाहिए एक पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के लिए उपलब्ध गठनात्मक परिणाम है, और misfolding और एकत्रीकरण के जोखिम के लिए विशेष रूप से. उदाहरण के लिए, हम एक थोक सेल ly की जांच हो सकती हैपश्चिमी सोख्ता द्वारा कुल प्रोटीन की ऊबाना, और तय है कि प्रोटीन ज्यादातर अघुलनशील और नहीं ubiquitinated है. हालांकि, जीवित कोशिका में प्रोटीन का एक असतत उप – जनसंख्या, पता लगाने के लिए जब कई कोशिकाओं औसत मुश्किल, घुलनशील और जहां प्रजातियों में स्थानीय एकाग्रता अत्यंत उच्च है एक विशेष डिब्बे में ubiquitinated हो सकता है. बाद के परिदृश्य बड़े थोक उप जनसंख्या की तुलना में सेल की व्यवहार्यता के लिए अधिक महत्वपूर्ण परिणाम हो सकते हैं. इसके अलावा, जबकि संरक्षिकाओं इन विट्रो में pleiotropic व्यवहार और कार्यों की एक किस्म प्रदर्शन, यह स्पष्ट होता जा रहा है कि सेल में उनके असतत कार्य spatially और अस्थायी रूप से सीमित कर रहे हैं.

जैव रसायन समझने के लिए नए उभरते प्रतिमान में एकाग्रता सेल में प्रत्येक विशिष्ट नैनो पर्यावरण की एक चर संपत्ति हो जाता है, और आणविक घटनाओं है कि जैविक प्रक्रियाओं आबाद न केवल समय में assayed किया जाना चाहिए, लेकिन यह भी spac मेंई. 4D इमेजिंग यहाँ प्रस्तुत दृष्टिकोण जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन misfolding के संवेदनशील मॉडलिंग के लिए सक्षम बनाता है, हालांकि यह अन्य जैविक प्रक्रियाओं के किसी भी संख्या का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और कैसे वे अंतरिक्ष में विनियमित रहे हैं, समय है, और पर्यावरण की स्थिति में परिवर्तन के बाद. इस पत्र में हम Ubc9 ^टीएस तह सेंसर का उपयोग करते हैं, जो प्रभावी चरणों cytosol में प्रोटीन एकत्रीकरण की शुरुआत के साथ निपटने के लिए और विकल्पों को दर्शाता है. एकत्रीकरण गुणवत्ता नियंत्रण की कोशिका जीव विज्ञान illustrating के अलावा, इस दृष्टिकोण Proteostasis (उदाहरण के लिए Ubc9 ^टीएस ऑक्सीकरण के लिए प्रतिक्रिया में प्रोटीन तह तनाव को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पर विशिष्ट perturbations या आनुवंशिक परिवर्तन के प्रभाव का गूढ़ रहस्य के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं, एक जहरीले कुल, या गुणवत्ता नियंत्रण के मार्ग में परिवर्तन) की अभिव्यक्ति.

4D इमेजिंग भी सही प्रोटीन या दो अलग अलग प्रोटीन के बीच स्थानीयकरण colocalization का निर्धारण करने के लिए आवश्यक हैहै, और जो शायद क्षणिक लेकिन महत्वपूर्ण घटना का पता लगाने के लिए. उदाहरण के लिए, खमीर जैसे एक छोटे गोलाकार जीव में विशेष रूप से, यह मामला है कि एक संरचना या कुल juxtanuclear स्थानीयकरण है, जबकि 4D इमेजिंग बता सकता है कि इस बस निरीक्षण के कोण की एक artifact है प्रकट हो सकता है.

उदाहरण प्रयोग हम यहां उपस्थित में, हम दिखाना एक मॉडल का उपयोग प्रोटीन, Ubc9 ^टीएस misfolded एकत्रीकरण और cytosol में समय और स्थान पर गुणवत्ता नियंत्रण का पालन करें. स्वतंत्र तापमान में, Ubc9 ^टीएस मुड़ा और नाभिक और cytosol में दूर तक फैला हुआ है. गर्मी प्रेरित misfolding पर, यह शुरू में तेजी से diffusing छोटे कुल तनाव foci कि proteasomal गिरावट के लिए कार्रवाई कर रहे हैं रूपों. जब एंटीबॉडी आंशिक रूप से हिचकते हैं, इन तनाव foci JUNQ और आइपॉड inclusions में के बारे में 2 घंटे के पाठ्यक्रम पर परिवर्तित कर रहे हैं. यदि ubiquitin की मध्यस्थता गिरावट एक गुणवत्ता नियंत्रण विकल्प, यूबी के रूप में उपलब्ध नहीं हैC9 ^टीएस तुरंत सुरक्षात्मक एकत्रीकरण के लिए आइपॉड शामिल किए जाने के लिए फिर से कराई. ये उपकरण उपन्यास आनुवंशिक एकत्रीकरण गुणवत्ता नियंत्रण में शामिल कारकों का पता चलता है, और अपने सेल में स्थानिक और लौकिक विनियमन का पता लगाने के लिए अविश्वसनीय अवसर प्रदान करते हैं.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
MG132	Mercury	mbs474790
con A	Sigma	C2010
Glass bottom plates	ibidi	ibd81158
			4D Fluorescence Imaging of Protein Aggregation Confocal 3D movies were acquired using a Nikon A1R-si microscope equipped with a PInano Piezo stage (MCL), using a 60X water objective NA 1.27, 0.3 micron slices, 0.5% laser power (from 65 mW 488 laser and 50 mW 561 laser). z-stacks were acquired every 5 min for 90 min. Each z-series was acquired with 0.5 micron step size and 30 total steps. Image processing was performed using NIS-Elements software.