Il metodo più comunemente utilizzato per generare un elevato numero di cellule dendritiche autologhe (DC) per uso in immunoterapia tumore è descritto. Il metodo utilizza IL-4 e GM-CSF per differenziare DC da monociti. Le DC immature sono stimolati a maturo e poi caricato con antigeni prima di essere iniettati nel paziente.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Preparazione del Tumor Antigen-caricati mature cellule dendritiche per l'immunoterapia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mentre gli studi clinici hanno dimostrato che i vaccini DC antigene-caricati sono al sicuro e promettente terapia per i tumori 1, la loro efficacia clinica rimane da stabilire. Il metodo descritto di seguito, redatto in conformità con buon processo di fabbricazione (GMP), è una ottimizzazione del metodo di preparazione ex vivo più comuni per la generazione di un gran numero di cellule dendritiche per gli studi clinici 2.
Il nostro metodo utilizza il TLR sintetico 3 agonista Polyinosinic-policitidilico Carbossimetilcellulosa acido poli-L-lisina (Poly-ICLC) per stimolare i PVS. Nostro studio precedente stabilito che Poly-ICLC è il più potente stimolo maturazione individuale per DCs umane valutata da una sovraregolazione di CD83 e CD86, induzione di interleuchina-12 (IL-12), fattore di necrosi tumorale (TNF), interferone gamma-indotta proteina 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), e interferoni di tipo I (IFN), e minimale interleuchina 10 (IL-10) di produzione. DC sono differenziati da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC congelati) ottenuti da leucaferesi. PBMC vengono isolati mediante centrifugazione su gradiente Ficoll e congelati in aliquote. Il giorno 1, PBMC vengono scongelati e piastrate su fiasche di coltura tissutale di selezionare per i monociti che aderiscono alla superficie plastica dopo 1-2 ore di incubazione a 37 ° C in incubatore coltura tissutale. Dopo l'incubazione i linfociti vengono lavati via ed i monociti aderenti sono coltivate per 5 giorni in presenza di interleuchina-4 (IL-4) e granulociti macrofagi fattore stimolante le colonie (GM-CSF) per differenziare a DC immature. Il giorno 6, DC immature vengono pulsate con l'emocianina di patella (KLH) keyhole proteina che serve come un controllo per la qualità del vaccino e può aumentare l'immunogenicità del vaccino 3. Le cellule dendritiche sono stimolati a maturare, caricati con antigeni peptidici, e incubate per una notte. Il giorno 7, le cellule vengono lavate, e congelati in aliquote da 1 ml contenente4 - 20 x 10 6 cellule usando un congelatore a velocità controllata. Controllo del rilascio del lotto per i lotti di DCS viene eseguito e deve soddisfare requisiti minimi prima di essere iniettati nel paziente.
Protocollo
1. Isolamento e Crioconservazione di PBMC 4
- Asetticamente Spike una delle porte di accesso nella borsa leucoaferesi utilizzando un set di trasferimento del plasma. Usando una siringa da 60 ml, trasferire il leucaferesi ottenute da pazienti in una bottiglia sterile da 500 ml.
- Regolare il volume della leucaferesi a 2x il suo volume originale con temperatura ambiente RPMI. Mescolare accuratamente.
- Mescolare delicatamente il flacone di Ficoll-Paque PLUS. Aggiungere 12 ml PLUS Ficoll-Paque in sterile da 50 ml tubo conico.
- Strato delicatamente 30 ml di prodotto diluito leucaferesi per ogni tubo da 50 ml conica sterile con....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Tra il 10 - 20% delle PBMC partire differenziarsi in cellule dendritiche al termine del periodo di coltura. DC mature sono CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, e CCR7 + (Figura 1). Essi esprimono alti livelli di MHC di classe I e II e le molecole di molecole co-stimolatorie CD80 e CD86. Poli-ICLC anche indotto livelli inferiori di PDL-1 rispetto ad altri agonisti TLR 14. Inoltre, questi Poly-IC-maturati dendritiche secernono grandi quantità di IL-12 (Figura 2 e 15,16) e.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Fase I e II di sviluppo clinico di DC derivate da monociti hanno dimostrato che inducono risposte immunitarie nei pazienti però il successo clinico è stato limitato 1. Ciò può essere dovuto in parte alla mancanza di consenso su come generare il DCS ottimali per uso immunotherapeutic tumore. Sebbene ci siano molti modi per generare DC ad uso clinico, questi metodi variano in termini di uso di citochine utilizzati per differenziare i monociti, stimoli usati per indurre la maturazione, e metodi di antigene caric.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori hanno ricevuto un sostegno finanziario dal seguente: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 e K08 AI084578 (Miller)), la Bill and Melinda Gates Foundation, Doris Duke Charitable Foundation, Cancer Research Institute, Alliance for Lupus Research, e l'Emerald Fondazione. Nina Bhardwaj è un coinventore su brevetti relativi alla preparazione e utilizzo di cellule dendritiche per manipolare l'immunità. Gli autori non hanno altre affiliazioni rilevanti o coinvolgimento finanziario con qualsiasi organizzazione o ente con un interesse finanziario in conflitto o finanziaria con l'oggetto o materiale discusso nel manoscritto oltre a quelle descritte.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Andres Salazar (Oncovir, Inc.) per il dono della Poli-ICLC.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 terreno con L-glutammina | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES soluzione salina tamponata | BioWhittaker | 17-737E | |
| soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Albumina umana, soluzione al 25% USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Siero AB umano | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Soluzione salina sterile USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0,5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 cm² EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti | Becton Dickinson | 353046 | |
| Fiale CryoTube da 1,8 ml | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Congelatore a velocità controllata | Thermo | CryoMed |
Riferimenti
- Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
- Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Esplora altri articoli
Preparazione di cellule dendriticheCellule mononucleate del sangue perifericoDifferenziamento dei monocitiStimolazione con Poly-ICLCCaricamento dell'antigene peptidicoCongelamento a velocità controllataMaturazione delle cellule dendriticheProduzione di vaccini per immunoterapiaElaborazione della leucaferesiAnalisi della secrezione di citochine
