Наиболее часто используемый способ генерирования большого количества аутологичных дендритных клеток (DC) для использования в иммунотерапии опухолей описано. Метод использует IL-4 и GM-CSF дифференцировать ДК из моноцитов. Незрелые ДК стимулируются, чтобы созреть и затем загружается с антигенами, прежде чем они вводятся обратно в организм пациента.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка опухолевый антиген нагруженных Зрелые дендритные клетки иммунотерапии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Хотя клинические исследования установили, что антиген-DC загруженных вакцины безопасны и перспективным для терапии опухолей 1, их клиническая эффективность еще предстоит установить. Метод, описанный ниже, подготовленной в соответствии с правилами процесса производства (GMP) руководящие принципы, является оптимизацией самых распространенных бывших естественных условиях подготовки способ генерации большого количества контроллеров домена для клинических исследований 2.
Наши способе используют синтетический агонист TLR 3 Полиинозиновую-полицитидилова кислота-поли-L-лизин-карбоксиметилцеллюлоза (Поли-ICLC), чтобы стимулировать DC. В предыдущем исследовании было установлено, что Poly-ICLC является самым мощным стимулом отдельных созревание для человека РС по оценке регуляция CD83 и CD86, индукции интерлейкина-12 (IL-12), фактор некроза опухолей (ФНО), интерферон гамма-индуцированной белок 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), интерфероны типа I (IFN) и минимальное интерлейкин-10 (IL-10) производства. ДК отличаются от замороженных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученного лейкаферез. РВМС выделяли центрифугированием в градиенте Ficoll и замораживают в аликвотах. В день 1 РВМС оттаивали, засевали на колбах культуры тканей, чтобы выбрать для моноцитов которые прилипают к пластиковой поверхности через 1-2 ч инкубации при 37 ° С в инкубаторе для тканевых культур. После инкубации лимфоцитов смываются и прилипшие моноциты культивировали в течение 5 дней в присутствии интерлейкина-4 (IL-4) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) дифференцироваться в незрелые ДК. На 6-й день, незрелые ДК импульсно гемоцианин лимфы улитки (KLH) белок, который служит в качестве контроля качества вакцин и может повысить иммуногенность вакцины 3. ДК стимулируются, чтобы созреть, нагруженных пептидных антигенов, и инкубировали в течение ночи. На 7 день, клетки промывают и замораживают в аликвотах 1 мл, содержащих4 - 20 × 10 6 клеток с использованием контролируемой скорости морозильной камеры. Лот тестирования расцепителя для партий ДК выполняется, и должны соответствовать минимальным требованиям, прежде чем они вводят пациентам.
Протокол
1. Выделение и криоконсервации МНПК 4
- Асептически шип одного из портов доступа в лейкафереза сумку с помощью набора переноса плазмы. С помощью 60 мл шприц, передавать лейкафереза, полученных от пациентов в стерильный 500 мл.
- Регулировка громкости лейкафереза в 2 раза от первоначального объема использованием RPMI комнатной температуре. Тщательно перемешать.
- Аккуратно перемешайте бутылку Фиколл Paque-PLUS. Добавить 12 мл Ficoll-Пак Плюс в стерильные 50 мл коническую трубку.
- Осторожно слой 30 мл разбавленного продукта лейкаферез друг стерильные 50 мл конические пробирки, содержащей Ficoll. Будьте осторожны, чтобы н....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В период с 10 - 20% исходного РВМС дифференцироваться в ДК в конце периода культивирования. Зрелые ДК являются CD11c +, CD14 +, CD83 +, CD40 + и CCR7 + (рис. 1). Они выражают высокие уровни MHC класса I и II молекул и молекул костимулирующую CD80 и CD86. Поли-ICLC также индуцирует более низкие уровни PDL-1 по сравнению с другими агонистами TLR 14. Кроме того, эти поли-IC-созрел ДК выделяют большое количество IL-12 (рис. 2 и 15,16) и вызывают пролиферацию аллогенных.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Фазы I и II клинических испытаний, полученных из моноцитов ДК показали, что они индуцируют иммунный ответ у пациентов, однако клинический успех был ограничен 1. Частично это может быть связано с отсутствием консенсуса о том, как для формирования оптимального РСУ иммунотерапевтический использования. Хотя существуют многочисленные способы получения клинического класса ДК, эти методы различаются с точки зрения использования цитокинов используется для дифференциации моноцитов, стимула используется, чтобы вызвать .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы получили финансовую поддержку из следующих: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 и K08 AI084578 (Miller)), Фонд Билла и Мелинды Гейтс, Дорис Дьюк благотворительный фонд, НИИ онкологии, Альянс за Волчанка исследований, и Изумрудное Foundation. Нина Bhardwaj является coinventor на патенты, связанные с подготовкой и использованием дендритных клеток манипулировать иммунитет. Авторы не имеют никакие другие соответствующие принадлежности или финансовое участие с любой организацией или организацией в финансовой заинтересованности в финансовом или конфликт с предметом или материалы обсуждаются в рукописи, кроме тех, раскрыта.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Андрес Салазар (Oncovir, Inc) за дар Poly-МКПЦН.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 среда с L-глутамином | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES буферизованный физиологический раствор | BioWhittaker | 17-737E | |
| Фосфатный буферный раствор (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Человеческий альбумин, 25% раствор USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Сыворотка AB человека | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Стерильный физиологический раствор USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Лейкин GM-CSF, 0,5 мг/мл | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Хилтонол, поли-ICLC, 2 мг/мл | Онковир | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 кв. см EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-луночные планшеты для культивирования тканей | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1,8 мл флаконы CryoTube | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
Ссылки
- Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
- Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
