Method Article

İmmünoterapi için Tümör Antijen-yüklü Olgun dendritik hücreler hazırlanması

DOI:

10.3791/50085

⸱

August 1st, 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Institute, NYU Langone Medical Center, 2Infectious Diseases, NYU Langone Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tümör immünoterapide kullanım için otolog dendritik hücreler, çok sayıda (DC'ler) oluşturmak için en yaygın olarak kullanılan yöntem tarif edilmektedir. Gibi bir yöntem monositlerden DC'ler ayırt etmek için, IL-4 ve GM-CSF kullanır. Bu hastaya geri enjekte edilmeden önce olgunlaşmamış DC'lerin olgun ve daha sonra antijen ile yüklenir için uyarılır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klinik çalışmalarda antijen yüklü DC aşıları güvenli ve tümörler 1 için umut verici tedavi olduğunu kurduk da, klinik etkinliği kurulacak kalır. Bir yöntem olup, İyi Üretim Prosesi (GMP) kurallarına uygun olarak hazırlanan, aşağıda açıklanan klinik çalışmalar 2 DC'lerin sayıda üretmek için en yaygın ex vivo olarak hazırlama yönteminin bir iyileştirmedir.

Bizim yöntem sentetik TLR 3 agonisti DC uyarmak için Polyinosinic-polisitidilik Asit-poli-L-lisin Karboksimetilselüloz (Poli-ICLC) kullanır. Daha önceki çalışmada, CD83 ve CD86, interlökin-12 indüksiyonu (IL-12), tümör nekroz faktörü (TNF), interferon gama-kaynaklı bir regülasyonu ile değerlendirildi gibi poli-ICLC insan DC'ler için en güçlü tek olgunlaşmasını teşvik olduğunu tespit Protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) ve tip I interferonlar (IFN), ve en az interlökin 10 (IL-10) üretimi. DC lökaferezis ile elde edilen dondurulmuş periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) ayrılıyor. PBMC, Ficoll gradyan santrifüj ile izole edildi ve alikotlar halinde dondurulur. 1. günde, PBMC çözülmüş ve ° C doku kültürü inkübatöründe 37 de 1-2 saat inkübasyondan sonra plastik yüzeye yapışma monositler seçmek için doku kültürü şişeleri üzerine kaplanmıştır. İnkübasyondan sonra, lenfositler yıkanır ve yapışık monositler interlökin-4 varlığında (IL-4) ve olgunlaşmamış DC'lerin ayırt etmek için, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF), 5 gün boyunca kültürlenmiştir. 6. günde, olgunlaşmamış DC'lerin aşı kalitesi için bir kontrol olarak hizmet eder ve aşı 3 immünojenisitesini artırmak olabilir anahtar deliği limpet hemosiyanin (KLH) proteini ile pals edilmiştir. DC'ler olgunlaşması için uyarılmış peptit antijen ile yüklenir ve bir gece inkübe edilir. 7. günde, hücreler yıkandı ve ihtiva eden 1 ml'lik kesirler dondurulur4 - kontrollü bir sınıf dondurucu kullanarak 20 x 10 6 hücre. DH partiler için çok sürümü test yapılır ve hasta enjekte edilmeden önce minimum teknik özellikleri karşılamalıdır.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. PBMC 4 İzolasyon ve Kriyoprezervasyon

  1. Aseptik başak bir plazma transfer seti kullanarak lökaferezis torbaya erişim limanlarından biri. 60 ml'lik şırınga kullanarak, steril bir 500 ml'lik şişe içine hastadan elde edilen lökaferezis aktarın.
  2. Oda sıcaklığında RPMI kullanarak orijinal ses 2x lökaferezis hacmi ayarlayın. Iyice karıştırın.
  3. Yavaşça Ficoll-Paque PLUS şişe karıştırın. Steril bir 50 ml'lik konik bir tüp içine 12 ml Ficoll Paque Plus eklenmesi.
  4. Ficoll içeren her bir steril 50 ml konik tüp seyreltilmiş lökaferezis ürünün yavaşça tabakası 30 mi. Ficoll ve hücre süspansiyonu arasındaki arayüz rahat....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

10 arası - Başlangıç ​​PBMC'ler% 20, kültür periyodunun sonunda DC'ler farklılaşırlar. Olgun DC CD11c olan +, CD14-, CD83 +, CD40 + ve CCR7 + (Şekil 1). Bunlar MHC sınıf I ve sınıf II molekülleri ile birlikte uyaran moleküller CD80 ve CD86 arasında yüksek düzeyde ifade eder. Diğer TLR agonistleri 14 ile karşılaştırıldığında, poli-ICLC da PDL-1 daha düşük düzeyde arttırmaktadır. Ayrıca, bu Poli-IC-olgunlaşmış DC'ler salgılar büyük IL-12 arasında miktarlarda (Şekil 2 ve 15.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Faz I ve II, monosit türevli DC'lerin klinik çalışmalarda, hastalar, ancak klinik başarıya 1 sınırlı olmuştur bağışıklık tepkileri ortaya göstermiştir. Bu tümör immünoterapötik kullanım için en uygun DC oluşturmak için nasıl fikir birliği eksikliği kısmen olabilir. Klinik dereceli DC oluşturmak için birçok yolu olmasına rağmen, bu yöntemler monositler, olgunlaşma ikna etmek için kullanılan uyarı ve antijen yükleme yöntemleri ayırt etmek için kullanılan sitokinlerin kullanımı açısından farklılık gösterir. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar aşağıdaki maddi destek aldık: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 ve K08 AI084578 (Miller)), Bill ve Melinda Gates Vakfı, Doris Duke Vakfı, Kanser Araştırma Enstitüsü, Lupus Araştırma İttifak ve Zümrüt Vakfı. Nina Bhardwaj hazırlanması ve bağışıklık işlemek için dendritik hücrelerin kullanımı ile ilgili patentleri bir coinventor olduğunu. Yazarlar herhangi bir diğer ilgili bağlantıları ya da bir finansal faiz veya ayrı ifşa olanlardan el yazması tartışılan konu veya malzeme ile mali çatışma ile herhangi bir kuruluş veya kurum ile finansal katılımı var.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Poly-ICLC armağanı için Andres Salazar (Oncovir, Inc) teşekkür etmek istiyorum.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
L-glutamin içeren RPMI-1640 ortamıBioWhittaker12-702F
1M HEPES tamponlu salinBioWhittaker17-737E
Fosfat tamponlu salin (PBS)BioWhittaker17-516F
İnsan albümini, %25 çözelti USPAventis Behring
Ficoll-Hypaque PREMIUMGE Sağlık17-5442-03
İnsan AB serumuValley BiomedicalHP1022
Steril salin USPHospira
CryoMACS DMSO Miltenyi Biotec170-076-303
Lösin GM-CSF, 0.5 mg / mlBerlexA02266
MACS GMP IL-4Miltenyi Biotec170-076-101
Hiltonol, Poli-ICLC, 2 mg / mlOncovirNA
VACMUNE KLHBiosyn
225 cm² EasyFlaskNalgene Nunc159934
Falcon 6 oyuklu doku kültürü plakalarıBecton Dickinson353046
1.8 ml CryoTube şişeleriNalgene Nunc377267
Kontrollü Hızlı DondurucuThermoCryoMed

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
  2. Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dendritic Cell PreparationPeripheral Blood Mononuclear CellsMonocyte DifferentiationPoly ICLC StimulationPeptide Antigen LoadingControlled Rate FreezingDendritic Cell MaturationImmunotherapy Vaccine ProductionLeukapheresis ProcessingCytokine Secretion Analysis

Related Articles