Vi beskriver en metod för avbildning av svar på anti-cancerbehandling<em> In vivo</em> Och vid en enda cell upplösning.
Tumören mikromiljö spelar en central roll i tumör initiering, progression, metastas, och svaret på cancerbehandlingar. Tredimensionella sam-odlingssystem används ofta för att explicera tumör-stroma interaktioner, inklusive deras roll i narkotika svar. Däremot kan många av det samspel som sker in vivo i den intakta mikromiljön inte helt replikeras i dessa in vitro-inställningar. Sålunda har direkt visualisering av dessa processer i realtid blivit ett viktigt verktyg för att förstå tumör svar på behandlingar och identifiera interaktioner mellan cancerceller och stroma som kan påverka dessa svar. Här ger vi en metod för att använda roterande skiva konfokalmikroskopi av levande, sövda möss att direkt observera läkemedelsdistribution, svar cancercell och förändringar i tumör-stroma interaktioner efter administrering av systemisk terapi i modeller bröstcancer. Vi beskriver förfaranden för labeling olika tumörer komponenter, behandling av djur för observation terapeutiska svar, och det kirurgiska ingreppet för att exponera tumörvävnad för avbildning upp till 40 timmar. De resultat som erhållits från detta protokoll tidsförlopp filmer, där sådana processer som drog infiltration, cancer celldöd och stromal migration kan utvärderas med hjälp av programvara bildanalys.
Solida tumörer består av två stora avdelningar: cancerceller och de stromala beståndsdelar (både cellulära och icke-cellulära) som hjälper till att upprätthålla en lämplig miljö för tumörtillväxt 1. Dessa stromala komponenter spelar avgörande roller i utvecklingen, utveckling och metastasering av många typer av cancer, däribland bröst 2-5. Den stromala miljö påverkar också terapeutiska responser 2,4,5. Sålunda, bestämma hur cancerceller svarar på konventionella och nya terapier inom ramen för den intakta mikromiljön är viktig för att främja vår förståelse av cancer biologi och förbättra dagens terapeutiska strategier. Dessutom definierar hur cancer cell-stroma interaktioner förändras efter administrering av behandlingen är avgörande för att förstå biologi tumörrecidiv.
Organotypic samodling system har varit till nytta för att studera tumör-stroma interaktioner <supp> 6, men det är uppenbart att de metoder som för närvarande är tillgängliga inte lyckas kan rekapitulera den intakta tumören mikromiljö in vitro, i synnerhet med avseende på vaskulär funktion och rekrytering av immunceller. Faktum cancercellinjer svar på behandlingar som observeras in vitro är ofta signifikant från dem som observerats in vivo, där mikromiljön är intakt 5. Således kan in vivo-modeller för att studera tumör-stroma interaktioner och deras inverkan på behandlingssvar bättre spegla kliniskt relevanta mekanismer 7.
Det primära sättet att studera reaktioner på anti-cancerbehandling in vivo har gått igenom mätningar av tumörstorlek och histologisk utvärdering av vävnader som härrör från behandlade djur eller patienter. Däremot har framsteg inom mikroskopi och fluorescerande reportrar under de senaste två decennierna gjort det möjligt att visualisering av inter-och intracellulära processermed hög upplösning i levande, sövda djur (intravital avbildning) 8. Dessa intravital mikroskopi tekniker har visat sig vara särskilt värdefullt för rumsligt och tidsmässigt dissekera in vivo dynamik tumör-stroma interaktioner vid cellulär och sub-cellulära upplösning 8,9.
Processer som har unraveled genom intravital avbildning inkluderar anti-tumör T-cell cytotoxicitet 10,11, interaktioner mellan T-celler och myeloida celler 12, dynamiken av förändringar i kollagen sammansättning och organisation efter terapeutisk behandling 13, makrofag-beroende cancercell intravasering och metastasering 14 och vaskulär permeabilitet 15.
Det finns tre huvudsakliga krav för intravital avbildning. Dessa inkluderar lämpliga förberedelser och exponering av vävnader för avbildning, fluorescerande märkning av vävnadskomponenter av intresse, och en parad mikroskopi-kamera ssystemprogram kan förvärva bilder 16. De vanligaste strategier som används för att hantera dessa krav är: 1) heterotopiska preparat (t.ex. inympning av örat eller ögat orbital), permanent avbildning fönster eller exterioriserades preparat (t.ex. rygghuden flik), 2) transgena fluorescerande reportrar och.. fluorescerande injicerbara att märka vävnadskomponenter, och 3) multiphoton eller konfokalmikroskopi system ihop med fotomultiplikatorrör eller charge-coupled device (CCD) kameror respektive 9. Vi använder en kirurgiskt preparerad modell hud flik för att exponera inguinal bröstkörteln för avbildning av sövda djur som uttrycker transgener som kodar fluorescerande reportrar. Bilder erhålls under en period av 12 till 40 timmar med en intensifierad CCD (ICCD) kamera paras ihop med en fyra-laser spinning skiva konfokalmikroskop systemet 17. Imaging på detta sätt har vi kunnat studera sådana processer som in vivo läkemedelsdistribution, steg-beroende lmemotherapeutic svar, typ av kemoterapi-inducerad celldöd och myeloid cellbeteende 5.
Vi erbjuder ett protokoll för intravital avbildning av svaren cancercellinjer till anti-cancerbehandling och tumör-stroma interaktioner i musmodeller av bröstcancer. Detta protokoll kan användas för att spåra beteenden och död för både cancerceller och stromala komponenter med ett brett utbud av transgena och injicerbara fluorescerande etiketter både transgena och transplantation modeller för perioder på upp till 40 timmar i en enda avbildning session.
Svaren av tumörer på systemiska behandlingar in vivo kan vara dramatiskt annorlunda med de av cancerceller in vitro, eftersom mikromiljön påverkar både akuta svaret och återfall 5. Ett av de största hindren för explicating in vivo chemoresistance vägar är komplicerade samspelet mellan cancerceller och deras mikromiljö. I synnerhet, eftersom solida tumörer har utvecklat en balans mellan cancer och stromaceller, perturbationer av en komponent, såsom celldöd som sker under anti-cancerbehandling, kan resultera i dramatiska effekter på vävnad organisation.
Den intravital bildteknik som här möjliggör direkt visualisering av cancer cell-stroma interaktioner inom tumörerna hos levande, bedövade möss under behandling med anti-cancerläkemedel. Vi använder spinnskivan konfokalmikroskopi, vilket har en relativt begränsad penetrationsdjup (se 17 </sup>), men våra kirurgiska och märkning tekniker kan användas med andra typer av mikroskopi. Filmer som förvärvats från dessa experiment kan användas för att spåra processer som inkluderar förändringar i fluorescensintensitet (t.ex. på grund av infiltration av en märkt population eller induktion av celldöd), cellmotilitet, distribution av injicerbara (t.ex. för att spåra vaskulär läckage) och co- lokalisering av fluorescerande signaler 5,12,17,20.
Vi rutinmässigt image möss för över 6 timmar och även utfört imaging i över 18 timmar. Detta kräver upprätthållande mössen kontinuerligt under anestesi för dessa långa tidsperioder. Med rätt anestesi, över 90% av våra djur överlever 6 timmar, och ca 80% överlever under 18 timmar. Detaljer om hur man utför en långsiktig anestesi har publicerats tidigare 19. Enligt vår erfarenhet fem faktorer är kritiska: undvika hypotermi, undvika uttorkning, upprätthålla fysiologiska blodet syremättnad, usjunger fuktad bärgas för isofluran, och hålla djuren på den lägsta nivån av anestesi vid vilken de inte visar tecken på smärta. För att upprätthålla kroppstemperaturen håller vi möss i en uppvärmd filt (vid 38 ° C). För att undvika uttorkning, injicera vi små volymer av saltlösning ip hela avbildning förfarande. För att bibehålla fysiologiska blodet syremättnad, börjar vi med 21% syre i bärgasen (snarare än vanliga 100%). Detta ger oss möjlighet att öka inhalerade syrenivåer om en mus – timmar i ett experiment – visar en minskning i blodet syrgasmättnad. I vår erfarenhet, öka inhalerade syrenivåer vid sådan tidpunkt (t.ex. 30-40%) nästan alltid kommer att stabilisera djuret möjliggör timmar av ytterligare avbildning. Den optimala nivån av anestesi är för de flesta möss uppnås med 1-1,5% isofluran och resulterar i andningsljud andelen 60-65/min och puls andelen 400-450/min. I våra imaging experiment använder vi främst transgen musmodells (MMTV-PyMT och C3 [1] Tag) där tumörer är multifokala, vilket möjliggör avbildning av multipla lesioner i olika stadier av tumörprogression parallellt på flera x-, y positioner under en enda avbildning session. Detta minskar oro mus-till-mus variation med avseende på experiment som syftar till att identifiera stadiet beroende terapeutiska responser, och minskar antalet djur som behövs för avbildning.
MMTV-PyMT modell (och andra spontana cancer modeller) går igenom progressiva histopatologiska steg som kan kännas igen under intravital avbildning, även om patologiska iscensättningen av tumör lesioner som kan göras under intravital avbildning skiljer sig från, och mindre detaljerad än den för histologiska snitt 5,17. Däremot transplantation modeller tenderar att återspegla sent stadium tumörer bäst, eftersom cancerceller vanligen isolerade från avancerade tumörer. Sådana modeller är därför mer mottagliga för att studera tumörer stromainteraktioner av sena stadium tumörer än skillnader i dessa interaktioner mellan olika stadier.
Vi visar exempel på hur bilden nukleära strukturella förändringar som inträffar efter celldöd inducerad av behandling. I frånvaro av anti-cancerbehandling, kan denna märkning strategi istället användas för att avbilda celldelning in situ belysa, exempelvis hur cellproliferation och dvala påverkas av mikromiljön. I framtiden kan fluorescerande märkning av mitokondriella komponenter gör det möjligt att avbilda mitokondriella förändringar som sker under apoptotisk celldöd.
I detta protokoll har vi visat också exempel på hur man kan bilden cancer cell-immunceller interaktioner efter terapi, men andra microenvironmental komponenter kan också visualiseras och avbildas. Befintliga transgena reporter linjer för stromala komponenter innefattar de för fibroblaster (t.ex.., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) eller celler i vaskulaturen (t.ex. Tie2-GFP 22, VEGF-GFP 23).
Intravital avbildning möjliggör realtid visualisering av interaktioner och processer som sker in vivo efter administrering av kemoterapi. Med den teknik som för närvarande finns tillgängliga, har vi gjort stora framsteg i att förstå hur myeloida celler påverkar terapeutiskt svar, men eftersom tumören mikromiljön är så komplex, är stora framsteg fortfarande behövs för att börja gräva mekanistiskt in i processer som ligger bakom miljö-medierad resistens. En av de viktigaste framstegen fortfarande krävs är att identifiera bättre markörer för specifika cellpopulationer. Vikten av bättre markörer är väl illustreras med två av de mest framstående stromacellinjer komponenter i brösttumör mikromiljön, fibroblaster och immunceller. α-glattmuskelaktin (αSMA) används ofta för att identifierafibroblaster, men proteinet uttrycks också av vaskulära glatta muskelceller och myoepithelial celler 24. Även om αSMA-GFP reporter möss finns bestämma den specifika celltypen som en följd av under ett intravital avbildning experiment är utmanande. På samma sätt kommer en enda fluorescerande markör såsom EGFP uttryckt under c-fms-promotorn identifiera ofta flera subpopulationer av immunceller 12,17. Även om man skulle helst vilja använda en enda markör för att identifiera en specifik celltyp komplexiteten i den underliggande biologin är en stor utmaning i att använda denna metod.
En partiell lösning på detta problem är att använda injicerbara etiketter för att ytterligare differentiera subpopulationer av celler som uttrycker samma fluorescerande reporter. Exempelvis fluorescerande dextraner tas upp av makrofager och kan användas för att märka de makrofag subpopulationer som är märkta av c-fms-EGFP och Fsp1-EGFP transgena möss reporter <sup> 17. Antikroppar konjugerade med fluorescerande prober har också använts för att identifiera specifika subpopulationer (t.ex. Gr1-positiva populationen av myeloida celler märkta med c-fms-EGFP reporter 17).
Till skillnad från tumör svarskurvor genereras av bromsok mätning, som ger lite mekanistisk information om hur eller varför tumörer svarar på den administrerade terapeutiska eller histologisk serier härrör från vävnader skördats vid olika tidpunkter som kräver stora kohorter av djur, ger vår teknik direkt, kvantifierbar information på dynamiken i celldöd och på växelverkan av stromala celler med cancerceller i små kohorter. Således är fördelen med att använda det förfarande som rapporterats här att det ger dynamisk information om läkemedels svar i samband med en intakt tumör mikromiljö i realtid. Sådan information kan leda till viktiga insikter i de underliggande processer som driver terapeutiska svar 5 </ Sup>.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar J. Cappellani och J. Qiu för teknisk support. Detta arbete stöddes av medel från National Cancer Institute (U01 CA141451), den Starr Cancer Consortium, Susan G. Komen för Cure, Long Island 2 dag promenad för att bekämpa bröstcancer, Manhasset Kvinnors Coalition Against Breast Cancer för mig, och en doktorander stipendium från congressionally Riktad Breast Cancer Research Program, är USA till ESNESN även mottagaren av Leslie C Snabb och William Randolph Hearst Foundation Fellowships från Watson School of Biological Sciences. HAA stöddes av medel från Norges forskningsråd (160698/V40 och 151.882), och sydöstra regionala hälsovårdsmyndigheter (2.007.060).
Reagent | |||
MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
C3(1)-Tag mice | Jackson Laboratory | 13591 | |
ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
ACTB-H2B-EGFP mice | Jackson Laboratory | 5418 | |
1 x PBS | Made in-house | ||
2 MD Dextran, Fluorescein-conjugated | Invitrogen | D-7137 | Reconstitute in dH2O (4 mg/ml, store at -20°C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-conjugated | Invitrogen | D-22914 | Reconstitute in dH2O (4 mg/ml, store at -20°C); dilute to 1 mg/ml in 1 x PBS |
Doxorubicin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | Reconstitute in dH2O and store at 4 °C; dilute in 1 x PBS |
Isothesia (Isoflurane) | Butler Animal Health Supply | 029450 | 250 ml |
Propidium iodide | Invitrogen | P3566 | 1 mg/ml; dilute 1:15 in 1 x PBS |
Nitrogen | |||
Oxygen | |||
Equipment | |||
18G x 1½” regular bevel needle | BD | 305196 | |
μManager | Vale Lab, UCSF | www.micro-manager.org | Open-source software |
Alcohol swab | BD | 326895 | 70% isopropyl alcohol swabs |
Anesthesia system | Molecular Imaging Products, Co. | ||
Cover glass | Corning | 2940-245 | No. 1½, 24×50 mm; disinfect with 70% isopropanol wipes |
Curity gauze sponges (sterile) | Kendall | 6939 | |
Glass microscope slides | Corning | 2948-75×25 | Pre-cleaned; if not pre-cleaned, disinfect with 70% isopropanol wipes |
Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | 2 pairs; stainless steel, sharp-sharp tips, straight tip, 26 mm cutting edge, 11 cm length |
Heated blanket | Gaymar Industries | ||
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn on approximately 30 min before use; sterilize tools at >200 °C for 30 sec |
Imaris | Bitplane | www.bitplane.com | |
Krazy Glue | Elmer’s Products | KG484 | |
Laboratory tape ( ½”) | |||
Laboratory tape (1″) | |||
Lid to a Styrofoam shipping cooler | This will be used as the surgical platform | ||
Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5153 | 1×2 teeth, slight curve, 0.8 mm tip width, 4″ length |
Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 | Serrated, slight curve, 0.8 mm tip width; 4″ length |
Microscope | Spinning-disk confocal, XYZ Piezo stage, epifluourescence capablility17,25 | ||
Microscope stage insert | Applied Scientific Instrumentation | Custom fabricated, with two circular imaging ports | |
MouseOx oximeter, software, and sensors | STARR Life Sciences | www.starrlifesciences.com | |
Nalgene Super Versi-Dry lab soakers | Thermo Scientific | 74218-00 | Cut into fourths for lining surgical platform |
Nebulizer | Salter Labs | 8901 | Used to humidify gases; prevents irritation of lung tissues |
Slip-tip disposable tuberculin syringe (1 ml) | BD | 309659 | |
Surflo winged infusion set | Terumo | SV-23BLK | 23G x ¾” ultra thin needle, 12″ tubing |
Betadine Spray | Purdue Pharma | BASP3H |