En roman protokol for den mekaniske tilberedning af testikelkræft cellesuspensioner fra gnaver materiale, undgå enzymer og rengøringsmidler, der er beskrevet. Fremgangsmåden er meget enkel, hurtig, reproducerbar, og gør god kvalitet cellesuspensioner, som er egnet til flow sortering og RNA-ekstraktion.
Mammale testikler er meget komplekse organer, der indeholder over 30 forskellige celletyper, herunder somatiske testikelceller og forskellige stadier af kønscelleoverførsel celler. Denne uensartethed er en vigtig ulempe vedrørende undersøgelse af grundlaget for pattedyr spermatogenesen, som rene eller beriget celle populationer i visse faser af udviklingen af sæd der er behov for de fleste molekylære analyser 1..
Forskellige strategier såsom Staput 2,3, centrifugal slæmning 1, og flowcytometri (FC) 4,5 er blevet anvendt til at opnå berigede eller oprensede testiklerne cellepopulationer for at muliggøre differential genekspressionsstudier.
Det kræves, at cellerne er i suspension fleste berigelse / oprensning tilgange. Ideelt set vil cellesuspensionen være repræsentativ for det oprindelige væv, har en høj andel af levedygtige celler og få multinucleates – som har en tendens til at danne grund afsyncytial karakter seminiferous epitel 6,7 – og mangel celleklumper 1.. Tidligere rapporter havde dokumenteret, at testiklerne cellesuspensioner udarbejdet af en udelukkende mekanisk metode klumpet lettere end trypsinerede dem 1.. På den anden side, behandlinger enzymatiske med RNAser og / eller disaggregering enzymer som trypsin og collagenase føre til specifikke makromolekyler nedbrydning, hvilket er uønsket for visse efterfølgende anvendelser. Den ideelle proces bør være så kort som muligt og involvere minimal manipulation, således at der opnås en god konservering af makromolekyler af interesse såsom mRNA'er. Nuværende protokoller til fremstilling af cellesuspensioner fra faste væv er normalt tidskrævende, stærkt afhængig af operatøren, og kan selektivt beskadige visse celletyper 1,8.
Protokollen præsenteres her kombinerer fordelene ved en meget reproducerbar og ultrakort mekanisk disaggregering med enbsence af enzymatisk behandling, hvilket fører til god kvalitet cellesuspensioner, der kan bruges til flowcytometrisk analyse og sortering 4, og skjulte genekspressionsstudier 9..
Den optimerede her beskrevne metode muliggør fremstillingen af cellesuspensioner fra gnaver testikelvævet i en meget hurtig og reproducerbar måde, der undgår enzym og vaskemiddel behandling og opretholde god celle integritet og type proportioner. Den korte procedure (15 min span omfatter testis dissektion, vævs skæring og forarbejdning), minimal involveret håndtering, og fravær af enzymatiske behandlinger er nogle af de vigtigste fordele. Alle disse ville forklare den gode bevarelse af korte levetid makrom…
Dette arbejde blev delvist støttet af CSIC (I + U-projekt C022) og PEDECIBA. Forfatterne vil gerne takke Mariela Bollati og Valentina Porro fra Cell Biology Unit (Institut Pasteur de Montevideo) for deres generøse samarbejde vedrørende MoFlo cellesorteringsapparat og Merial-Montevideo for forsigtigt give alle de marsvin prøver, der anvendes i dette projekt. Figur 1 blev gengivet med tilladelse fra BioMed Central, figur 2 og 3, og tabel 1 med tilladelse fra S. Karger AG, Basel, og figur 4 og 5 er gengivet eller tilpasset med tilladelse fra John Wiley & Sons, Inc (ophavsret ejes af Wiley- Blackwell, 2011).
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
Medimachine system | BD | 340587 | |
Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
DMEM | Gibco | 430-2100 | |
Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |