Isolering og analyse av Brain-sequestered Leukocytter fra<em> Plasmodium berghei</em> ANKA-infiserte mus
Summary
En metode for isolering av adherente inflammatoriske leukocytter fra hjernen blodkarene<em> Plasmodium berghei</em> ANKA-infiserte mus, er beskrevet. Fremgangsmåten tillater kvantifisering samt fenotypisk karakterisering av isolerte leukocytter etter farging med fluorescerende antistoffer og påfølgende analyse ved strømningscytometri.
Abstract
Vi beskriver en fremgangsmåte for isolering og karakterisering av adherente inflammatoriske celler fra hjernen blodkar av P. Berghei ANKA-infiserte mus. Infeksjon av mottakelige mus-stammer med denne parasitten belastning fører til induksjon av eksperimentelle cerebral malaria, en nevrologisk syndrom som rekapitulerer visse viktige aspekter av Plasmodium falciparum-mediert alvorlig malaria hos mennesker 1,2. Modne former av blod-trinns malaria uttrykker parasittiske proteiner på overflaten av infiserte erytrocytt, som tillater dem å binde til vaskulære endotelceller. Denne prosessen induserer hindringer i blodstrømmen, noe som resulterer i hypoksi og blødninger 3 og også stimulerer til rekruttering av inflammatoriske leukocytter til området av parasitten håndtering.
I motsetning til andre infeksjoner, dvs. neutrotopic virus 4-6, begge malaria-parasitized røde blodceller (PRBC) samt tilhørende inflammatory leukocytter forblir sequestered i blodkar enn infiltrere hjernen parenchyma. Dermed å unngå forurensning av sequestered leukocytter med ikke-inflammatoriske sirkulerende celler, omfattende intracardial perfusjon av infiserte-mus før organ utvinning og vev behandling er nødvendig i denne prosedyren for å fjerne blod kupé. Etter perfusjon blir hjerner høstes og dissekert i små biter. Vevet strukturen er ytterligere forstyrret ved enzymatisk behandling med kollagenase D og DNAse I. Det resulterende hjerne Homogenatet deretter sentrifugert på en Percoll gradient som tillater separasjon av hjerne-sequestered leukocytter (BSL) fra myelin og andre vev rusk. Isolerte celler vaskes deretter, telles ved hjelp av en hemocytometer og farget med fluorescerende antistoffer for etterfølgende analyse ved strømningscytometri.
Denne prosedyren gir omfattende fenotypisk karakterisering av inflammatoriske leukocytter migrere til hjernen i reutvikling som svar på ulike stimuli, inkludert slag, så vel som virale eller parasittiske infeksjoner. Metoden gir også et nyttig verktøy for vurdering av nye anti-inflammatorisk behandling i pre-kliniske dyremodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolering og analyse av BSL er en metode som tillater karakterisering og kvantifisering av betennelsesceller migrere til hjernen i respons til vevsskade eller infeksjon i eksperimentelle musemodeller. Innføringen av en intracardial perfusjon steg for fjerning av blod kupé før orgel utvinning og påfølgende celleisolasjon er nyttig for å hindre kontaminering av inflammatoriske celler med ikke-inflammatoriske sirkulerende leukocytter. Dette kan ikke være et viktig krav i neurotropisk infeksjoner som murint encefalom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Miss Liana Mackiewicz for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble gjort mulig gjennom viktoriansk delstatsmyndighetene Operasjonell Infrastruktur Support og australske regjeringen National Health and Medical Research Council IRIISS og Project Grant 1031212.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa’s azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 |
References
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
