Summary

脳から隔離された白血球の単離と解析<em>マラリアベルゲイ</em> ANKA感染マウス

Published: January 02, 2013
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Summary

の脳血管から付着炎症性白血球を単離するための方法<em>マラリアベルゲイ</em> ANKA感染マウスが記載されている。この方法は、フローサイトメトリーによって蛍光抗体とその後の分析で染色した後に定量化ならびに単離された白血球の表現型の特徴を可能にします。

Abstract

我々はPの脳血管から付着炎症細胞の単離および特性評価のための方法を説明ベルゲイ ANKA感染マウス。実験的脳マラリア、人間1,2における熱帯熱マラリア原虫媒介重症マラリアの再現する一定の重要な側面、その神経学的症候群の誘導にこの寄生虫のひずみの結果と感受性マウス系統の感染。血液段階のマラリアの成熟型は、それらが血管内皮細胞に結合することができます感染赤血球の表面に寄生するタンパク質を発現している。このプロセスでは、低酸素症および出血3、その結果、血流に障害を誘発し、また寄生虫隔離のサイトに炎症性白血球の動員を刺激する。

他の感染症とは異なり、すなわちneutrotopicウイルス4-6、両方マラリア寄生赤血球(PRBC)ならびに関連inflammatory白血球は血管内ではなく、脳実質に浸潤するより隔離のままである。したがって、非炎症性の循環細胞、臓器の抽出と組織の処理の前に感染したマウスの大規模な心臓内灌流による隔離白血球の汚染を避けるために、血液区画を削除する場合は、この手順が必要になります。灌流後、脳を採取し、小片に解剖した。組織構造は、さらにその結果脳ホモジネートは、その後ミエリンおよび他の組織片から脳隔離された白血球の分離(BSL)が可能パーコール勾配に遠心分離されるコラゲナーゼDとDNase Iで酵素処理によって破壊されています。単離された細胞は、その後、フローサイトメトリーによってその後の分析のための蛍光抗体と血球計数器とステンドを使用してカウントし、洗浄する。

この手順では、炎症性白血球の包括的な表現型の特徴は、再の脳への移行を可能にするストロークだけでなく、ウイルスや寄生虫感染症を含む様々な刺激に応答特性。この方法はまた、前臨床動物モデルにおける新規抗炎症治療の評価のための便利なツールを提供します。

Protocol

1。 P.によるマウスの感染ベルゲイ -ANKA 霜凍結保存Pのアリコートベルゲイ ANKA PRBC。 両手拘束技術を用いて、脳マラリア耐性のBALB / cドナーマウス(8-12週齢)を抑制する。 1mlのインスリン注射器(28G針)を使用して、PRBCの100から200μlでマウスを注入します。日常的に、1-2ドナーマウスが注入される。 感染後4-5日で(pi)をケージからドナーマ?…

Representative Results

図の結果。 2に示す比率と灌流したりunperfusedマラリアに感染し、ナイーブ対照マウスの脳から回収された別のBSLの人口の絶対数。議定書のテキストに示されているように隔離されたBSLは、PE-抗NK1.1およびAPC-抗TCR-β抗体で染色した。 7月9日以前の知見と一致して、αβTCR+ T細胞は、灌流しマラリア感染マウス(6日目PI)の脳におけるBSLプールの高い割合を占めている。この集団?…

Discussion

BSLの単離と解析、特性評価および実験マウスモデルにおける組織損傷または感染に反応して脳への移行の炎症性細胞の定量化を可能にする方法です。臓器の抽出とそれに続く細胞単離の前に血液区画の除去のための心臓内灌流ステップの導入は、非炎症性の循環白血球と炎症細胞の汚染を防止するのに有用である。これは、炎症細胞が脳実質5を貫通ているようなマウス脳?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は、技術支援のためにミスリアナMackiewiczに感謝したいと思います。この作品は、ビクトリア州政府業務インフラのサポートとオーストラリア政府は国立保健医療研究評議会IRIISSとプロジェクト無償1031212により可能となった。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Solutions and buffers
Giemsa’s azur eosin methylene blue solution Merck Millipore 1.09204.0500 1:10 dilution in distilled water
RPMI medium Mouse tonicity
Mouse tonicity PBS 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3
0.4%Trypan Blue Sigma Aldrich T-8154 1:2 dilution
Collagenase D Worthington Biochemical
Deoxyribonuclease (DNAse) I Sigma Aldrich D4263-5VL From bovine pancreas
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 30% solution in PBS
Ultrapure Tris Invitrogen 15505-020
Ammonium Chloride (NH4Cl) AnalaR 10017
Red Cell Lysis Buffer 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2
FCS Gibco 1009
EDTA disodium salt Merck 10093.5V 0.1M, pH 7.2
Antibodies and conjugates
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 BD Pharmingen 553142 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml)
FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 BD Pharmingen 553651
PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 BD Pharmingen 553165
PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 BD Pharmingen 551162
APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 BD Pharmingen 553174
PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 R&D Systems FAB1685P
Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 BD Pharmingen 559922
Steptavidin-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 551419
Equipment and material
SuperFrost microscope slide Lomb Menzel-Gläser
Dissection forceps, scissors REDA Instrumente
500 ml PBS reservoir Nalgene
Rubber tubing
23G needle BD PrecisionGlide 302008
Cell dissociation kit containing metal sieve Sigma Aldrich CD-1
70 μm nylon cell strainer BD Falcon 352350
Hemocytometer GmbH Neubauer 717810
Flow cytometry tubes BD Falcon 352008

References

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Cite This Article
Ryg-Cornejo, V., Ioannidis, L. J., Hansen, D. S. Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice. J. Vis. Exp. (71), e50112, doi:10.3791/50112 (2013).

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