प्रायोगिक मानव न्यूमोकोकल कैरिज

Summary

प्रायोगिक मानव न्यूमोकोकल गाड़ी गाड़ी का एक प्राकृतिक मॉडल और वैक्सीन के विकास में उपयोग करने के लिए एक संभावित मॉडल प्रदान करता है. इस तकनीक मूल्यवान अभी तक जटिल है और एक मानव में एक रोगज़नक़ शुरू करने से नैदानिक ​​जोखिम शामिल है. हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल विकसित किया है.

Abstract

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major source of transmission and the prerequisite of invasive disease. A model of carriage will allow accurate determination of the immunological correlates of protection, the immunizing effect of carriage and the effect of host pressure on the pathogen in the nasopharyngeal niche. Further, methods of carriage detection useful in epidemiologic studies, including vaccine studies, can be compared.

Aim

We aim to develop an EHPC platform that is a safe and useful reproducible method that could be used to down-select candidate novel pneumococcal vaccines with prevention of carriage as a surrogate of vaccine induced immunity. It will work towards testing of candidate vaccines and descriptions of the mechanisms underlying EHPC and vaccine protection from carriage¹. Current conjugate vaccines against pneumococcus protect children from invasive disease although new vaccines are urgently needed as the current vaccine does not confer optimal protection against non-bacteraemic pneumonia and there has been evidence of serotype replacement with non-vaccine serotypes^2-4.

Method

We inoculate with S. pneumoniae suspended in 100 μl of saline. Safety is a major factor in the development of the EHPC model and is achieved through intensive volunteer screening and monitoring. A safety committee consisting of clinicians and scientists that are independent from the study provides objective feedback on a weekly basis.

The bacterial inoculum is standardized and requires that no animal products are inoculated into volunteers (vegetable-based media and saline). The doses required for colonization (10⁴-10⁵) are much lower than those used in animal models (10⁷)⁵. Detecting pneumococcal carriage is enhanced by a high volume (ideally >10 ml) nasal wash that is relatively mucus free. This protocol will deal with the most important parts of the protocol in turn. These are (a) volunteer selection, (b) pneumococcal inoculum preparation, (c) inoculation, (d) follow-up and (e) carriage detection.

Results

Our current protocol has been safe in over 100 volunteers at a range of doses using two different bacterial serotypes⁶. A dose ranging study using S. pneumoniae 6B and 23F is currently being conducted to determine the optimal inoculation dose for 50% carriage. A predicted 50% rate of carriage will allow the EHPC model to have high sensitivity for vaccine efficacy with small study numbers.

Protocol

1. चयन और स्क्रीनिंग स्वयंसेवी स्वस्थ स्वयंसेवकों पोस्टर विज्ञापन के माध्यम से और विश्वविद्यालय की वेबसाइट पर एनएचएस अनुसंधान और आचार समिति के मार्गदर्शन के अनुसार भर्ती कर रहे हैं. भाग लेने के लिए शामिल किए जाने के मापदंड हैं: 18-60 वर्ष आयु वर्ग के वयस्कों के. धाराप्रवाह अंग्रेजी बोलते हैं और दोनों मोबाइल फोन और पाठ संदेश के द्वारा आसानी से संवाद करने में सक्षम है. भाग लेने के लिए अपवर्जन मानदंड हैं: जोखिम वाले व्यक्तियों (बच्चों, वयस्कों immunosuppressed, बुजुर्ग, पुरानी बीमार स्वास्थ्य) के साथ संपर्क बंद करें. वर्तमान धूम्रपान न करने या महत्वपूर्ण धूम्रपान इतिहास (पैक> 10 वर्ष). अस्थमा या अन्य सांस की बीमारी. गर्भावस्था. पेनिसिलिन या amoxicillin के लिए एलर्जी. अवलोकन जब तक या गैर interventional चरण में एक और चिकित्सीय परीक्षण में वर्तमान भागीदारी. करने के लिए पूरी तरह से सूचित सहमति देने में असमर्थ है. एक प्रारंभिक जांच की यात्रा, टीका से पहले लगभग एक सप्ताह, एक केंद्रित नैदानिक ​​इतिहास और लक्षित नैदानिक ​​परीक्षा भी शामिल है. यदि एक पहले से अपरिचित विषमता पाया जाता है, स्वयंसेवक अध्ययन से बाहर रखा जाएगा और प्राथमिक स्वास्थ्य देखभाल के माध्यम से उचित जांच की व्यवस्था की जाएगी. प्रारंभिक जांच के दौरान एक पूर्ण रक्त सुनिश्चित करें कि सफेद सेल गिनती टीका यात्रा से पहले सामान्य श्रेणी के भीतर प्राप्त की गिनती पर जाएँ. एक नाक धोने के लिए प्राकृतिक न्यूमोकोकल वाहक बाहर (6.1 देखें) के लिए किया जाता है. टीका करने से पहले, स्वयंसेवकों अध्ययन में भाग लेने के साथ जुड़े जोखिम पर शिक्षित कर रहे हैं और एक आपातकालीन रोगी पत्रक, डिजिटल थर्मामीटर, आपातकालीन टेलीफोन नंबर और amoxicillin का 3 दिवसीय पाठ्यक्रम के साथ प्रदान की जाती हैं. 2. टीका स्टॉक की तैयारी टीका शेयरों की तैयारी एक स्वच्छ वातावरण में किया जाना चाहिए. pipettes इस्तेमाल केवल उपयोग किया जाना चाहिएघ inoculum तैयारी के लिए. सभी कांच और प्लास्टिक के बर्तन बाँझ होना चाहिए. हम अनुशंसा करते हैं कि टीका शेयरों एक समर्पित कमरे में तैयार हो सकता है, एक समर्पित fumehood और इनक्यूबेटर का उपयोग. न्यूमोकोकल उपभेदों एक रक्त अगर प्लेट पर inoculated हैं. प्लेट्स 5% सीओ 2 रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे हैं. अगले दिन सभी बैक्टीरिया रक्त अगर थाली से scraped है और एक मनका स्टॉक संरक्षण प्रणाली में inoculated. इन मनका स्टॉक टीका स्टॉक की तैयारी के लिए उपयोग किया जाता है. एक टीका स्टॉक तैयार करने से पहले टेस्ट संदूषण और कॉलोनी एकरूपता के लिए मनका शेयरों. टीका स्टॉक तैयार करने के लिए वांछित न्यूमोकोकल सीरोटाइप मनका स्टॉक से दो मोतियों के साथ एक रक्त अगर प्लेट टीका लगाना, पूरी थाली को कवर streaking. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ रातोंरात 2 में प्लेटें सेते हैं. सभी आगे incubations ये एक ही स्थितियों का उपयोग करेगा. इसके अलावा Vegitone सुनिश्चित करने के लिए बाँझपन रातोंरात मीडिया सेते हैं. अगली सुबह झाड़ू1/2 थाली, देखभाल करने के दूर करने के लिए नहीं किसी भी रक्त अगर, और पूर्व गर्म Vegitone शोरबा के 12 मिलीलीटर जोड़ें. थाली के दूसरे आधे का उपयोग दोहराएँ. 37 डिग्री सेल्सियस से कम दो 12 मिलीलीटर की शीशियों के लिए 2 घंटे या जब तक turbidity में एक परिवर्तन स्पष्ट हो जाता है छोड़ दो, जो भी पहले आता है. पूर्व गर्म Vegitone शोरबा के 40 मिलीलीटर 12 मिलीलीटर जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से. अन्य 12 मिलीग्राम शीशी के लिए दोहराएँ. यह समय बिंदु = 0 है. 600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को पढ़ने के लिए 100 μl निकालें. कॉलोनी बनाने (CFU) इकाई गिनती मील और मिश्रा (एम एंड एम) 7 द्वारा विधि का एक भिन्नरूप का उपयोग करके बैक्टीरिया की मात्रा का ठहराव के लिए 20 μl निकालें. दोनों शीशियों सेते हैं. एम एंड एम के लिए, छह वर्गों में एक रक्त अगर प्लेट को विभाजित. एक 96 अच्छी तरह से थाली के छह कुओं (U – नीचे) बाँझ पीबीएस के 180 μl जोड़ें. ऊपर अच्छी तरह से और मिश्रण शोरबा के 20 μl जोड़ें. Serially नमूना 1:10 छह बार कमजोर और 6 अच्छी तरह से 20 μl त्यागें. प्लेस तीन 10 के पहले खंड में शीर्ष अच्छी तरह से μl बूँदेंरक्त अगर प्लेट. पांच अन्य कुओं के लिए दोहराएँ. थाली सूखा है पहले यह उलटा है और incubated सुनिश्चित करें. अगले दिन प्रत्येक कमजोर पड़ने अनुभाग और रिकार्ड में दिखाई कालोनियों की संख्या गिनती. 30 और 300 के बीच एक गिनती के साथ कमजोर पड़ने अनुभाग का प्रयोग, तीन द्वारा दिखाई कालोनियों की संख्या में विभाजित करने के लिए एक औसत प्राप्त. कमजोर पड़ने कारक द्वारा कालोनियों के औसत संख्या गुणा और फिर 10 (10 μl ड्रॉप की राशि) से विभाजित. यह CFU / μl देता है. 1000 से इस संख्या को गुणा CFU / मिलीलीटर. एम एंड एम विधि हर घंटे प्रदर्शन आयुध डिपो 600 रीडिंग और बैक्टीरिया की मात्रा का ठहराव तक प्रारंभिक चरण मध्य लॉग तक पहुँच है, 0.25 के एक आयुध डिपो. एक बार यह आयुध डिपो पर पहुंच गया है, एक शीशी निष्फल 10% ग्लिसरॉल जोड़ने और 1 मिलीलीटर aliquots तैयार. -80 पर स्टोर aliquots डिग्री सेल्सियस एक और अधिक ध्यान केंद्रित शेयर के लिए, 15 मिनट के लिए 3345 XG अन्य शीशी अपकेंद्रित्र और तैरनेवाला हटा दें. Vegiton की 22.5 मिलीलीटर में गोली Resuspendई मध्यम और 10% ग्लिसरॉल जोड़ें. -80 में 1 मिलीलीटर aliquots और दुकान तैयार डिग्री सेल्सियस -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक विगलन और बढ़ाता से पहले कम से कम 48 घंटे के लिए छोड़ दें. एम एंड एम विधि से जमे हुए बैक्टीरियल स्टॉक यों. तीन शेयर ट्यूबों व्यक्तिगत टेस्ट करने के लिए reproducibility सुनिश्चित. वांछित खारा में inoculum एकाग्रता शेयर पतला, के रूप में नीचे वर्णित प्राप्त मूल्य का उपयोग करें. एक टीका के लिए, पहले और बाद में टीका inoculum में pneumococci की मात्रा की गणना की जाती है. एम एंड एम विधि द्वारा बैक्टीरिया की इस मात्रा का ठहराव inoculum जो समय यह पूरी प्रक्रिया को पूरा करने के लिए लेता है के लिए खातों में pneumococci की औसत संख्या का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एक inoculum तैयार, इच्छित एकाग्रता के लिए गिराए, मात्रा का ठहराव और एम एंड एम "पूर्व टीका" गिनती के लिए विधि द्वारा प्रदर्शन. हमारे क्लीनिकल रिसर्च सुविधा में यह टीम पूरे टीका प्रक्रिया को पूरा करने के लिए 30 मिनट लगते हैं. पी.एन.खारा में eumococcal निलंबन आमतौर पर इस अंतराल में एक कम गिनती दिखा देंगे. इस के लिए खाते हैं, हम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर पतला inoculum बैठते हैं और फिर एक के बाद टीका "एम एंड एम विधि द्वारा जीवाणुओं की मात्रा का ठहराव प्रदर्शन. पहले और बाद की औसत अंतिम inoculated एकाग्रता का निर्धारण. अपने नैदानिक ​​प्रोटोकॉल के अनुसार "बैठे" समय समायोजित करें, लेकिन के रूप में संभव के रूप में संक्षिप्त अंतराल रखें. सभी नए स्टॉक स्टॉक पवित्रता और पहचान की पुष्टि के लिए एक संदर्भ प्रयोगशाला के लिए भेजा जाना चाहिए. 3. Inoculum तैयारी Inoculum की तैयारी अनुसूचित स्वयंसेवक टीका नियुक्ति से पहले 30 मिनट से शुरू करना चाहिए. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर के एक से पहले बनाया स्टॉक ट्यूबों के बाहर ले जाओ, यह पिघलना और microcentrifuge में 3 मिनट के लिए 17,000 XG पर ट्यूब स्पिन. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में गर्म खून अगर प्लेटें. तैयार करना96 एम एंड एम विधि द्वारा जीवाणु मात्रा का ठहराव के लिए अच्छी तरह से थाली और इच्छित खुराक के लिए अनुसार कमजोर पड़ने ट्यूबों तैयार. Centrifuged ट्यूब से शोरबा तैरनेवाला निकालें और खारा के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend. इस कदम से inoculum शोरबा को हटा. Centrifugation कदम दोहराएँ. खारा तैरनेवाला निकालें और खारा के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend. वांछित inoculum एकाग्रता के लिए कमजोर पड़ने सेट निष्पादित और एम एंड एम के विधि द्वारा मात्रा ठहराना. स्वयंसेवक नियुक्ति inoculum लो और स्वयंसेवकों inoculating के बाद, प्रयोगशाला में मात्रा का ठहराव को दोहराने. -80 पर तारीख और inoculum खुराक और दुकान के साथ ट्यूब लेबल ° सी. टीका से टीका करने के लिए निरंतरता सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है के लिए एक ही pipettes और समर्पित प्रयोगशाला के उपकरण हर समय का उपयोग करें. 4. टीका अर्द्ध लेटा हुआ स्थिति में स्वयंसेवकों आराम से बैठे चाहिए. <li> एक P200 विंदुक का प्रयोग और बाँझ फ़िल्टर inoculum की 100 μl आकर्षित और नाक गुहा के अंदर टिप डालने. धीरे धीरे एक परिपत्र गति का उपयोग नाक mucosa पर inoculum निष्कासित. यह महत्वपूर्ण है कि विंदुक टिप नाक mucosa के साथ संपर्क में नहीं आता है उपकला की अखंडता में व्यवधान के रूप में खून में प्रवेश करने बैक्टीरिया में परिणाम सकता है. यह भी महत्वपूर्ण है कि inoculum भी वापस दूर नहीं रखा है या यह गले से नीचे चला जाएगा, यह नाक गुहा के अंदर होनी चाहिए. अन्य Naris के लिए दोहराएँ. क्या स्वयंसेवक 10 मिनट के लिए अर्द्ध लेटा हुआ स्थिति में सूँघने या नाक उड़ाने के बिना रहना. इस बैक्टीरिया के लिए समय mucosa भर में फैलाने के लिए अनुमति देता है. 5. निगरानी स्वयंसेवकों दैनिक टीका के बाद निगरानी कर रहे हैं. यह एक दैनिक पाठ स्वयंसेवक द्वारा 2 बजे से पहले जांचकर्ताओं को भेजे गए संदेश में शामिल हैं. यदि पाठ मैंs प्राप्त स्वयंसेवक उसका / उसकी अच्छी तरह से किया जा रहा है, यह सुनिश्चित करने के लिए संपर्क किया जाएगा नहीं 2 बजे तक. अगर वह / वह जवाब नहीं है, रिश्तेदारों के आवंटित अगले स्वयंसेवक अच्छी तरह से किया जा रहा है, यह सुनिश्चित करने के लिए संपर्क किया जाएगा. स्वयंसेवकों को हर नियुक्ति पर कोई ऊपरी श्वास पथ के लक्षणों पर रिपोर्ट करने के लिए कहा जाता है. चिकित्सीय स्टाफ स्वयंसेवक पूछने के लिए उसकी / उसके लक्षण वर्णन होगा और किसी भी शिकायत का पालन करेंगे. स्वयंसेवकों को दी एंटीबायोटिक दवाओं केवल तीन परिस्थितियों के तहत लिया जाना, घटना है कि वे अस्वस्थ हैं और कर रहे हैं उन्हें अनुसंधान दल द्वारा लेने के निर्देश दिए है, अगर वे अध्ययन के अंत में pneumococcus ले जा रहे हैं, या अगर वे अस्वस्थ हैं और अनुसंधान टीम से संपर्क करने में असमर्थ है. स्वयंसेवक अध्ययन के दौरान उनके साथ हर समय में इस आपातकालीन पैक रखने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है और अगले 7 दिनों के लिए एक दैनिक आधार पर शोध टीम से संपर्क करने का अनुरोध किया है. हमारी टीम के काम के घंटे के दौरान नर्स संपर्क के साथ 24/7 उपलब्ध है और दो डाक्टर उपलब्ध हो से बाहरउर्स. सभी प्रश्नों के साथ टेलीफोन कॉल और / या तत्काल समीक्षा से निपटा रहे हैं. प्रावधान तत्काल, एक संक्रामक रोग वार्ड में सीधे प्रवेश के लिए उपलब्ध हैं, अगर जरूरत है. 6. नाक धो प्रक्रिया (NW) नाक washes (NW) एक प्रारंभिक जांच यात्रा, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 48 घंटा, 7, और 14 दिनों के बाद टीका में प्रदर्शन कर रहे हैं. NW विधि का इस्तेमाल किया Naclerio एट अल से लिया जाता है. 8 स्वयंसेवक स्वाभाविक रूप से एस द्वारा उपनिवेश निमोनिया टीका से बाहर रखा जाता है और ऊपर का पालन करें. स्वयंसेवक आराम से बैठा है और सिर को पीछे झुका हुआ है ऊर्ध्वाधर से 30 °. स्वयंसेवक पूछो में एक गहरी साँस ले और अपनी जीभ धक्का और पीछे की ओर मुँह की छत के खिलाफ whilst उनकी सांस पकड़. इस स्थिति में Whilst, स्वयंसेवक के लिए संकेत है कि वे तैयार हैं के लिए कहा है. एक 20 मिलीलीटर नमक के साथ भर सिरिंज पूर्वकाल नाक अंतरिक्ष में डाला जाता है और खारा के 5 मिलीलीटर निष्कासित कर दिया है. volunteer तो तुरंत आगे leans और एक पन्नी कटोरा में उनकी नाक के माध्यम से तेजी से exhaling द्रव expels. इस प्रक्रिया को दोहराएँ 3 गुना अधिक ताकि प्रत्येक Naris दो बार धोया गया है और पूरे 20 मिलीलीटर इस्तेमाल किया गया है. सभी नमूने अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक साथ पूल और प्रसंस्करण के लिए कमरे के तापमान पर प्रयोगशाला के लिए भेजें. 7. नाक धोने प्रोसेसिंग +३३४५ X छ पर 10 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र. -80 में और लेबल Eppendorf ट्यूब में 1 मिलीलीटर aliquots के रूप में सतह पर तैरनेवाला दुकान निकालें ° सी. गोली 9 मध्यम STGG के 100 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से. सुनिश्चित करें कि इस बिंदु पर ट्यूब में कुल मात्रा निर्धारित किया जाता है. यह कमजोर पड़ने एक गाड़ी सकारात्मक NW CFU की गणना में इस्तेमाल किया जाएगा. एक एक रक्त अगर gentamicin और लकीर पूरी थाली युक्त थाली पर resuspended गोली युक्त STGG के 20 μl ड्रॉप प्लेट. यदि एनडब्ल्यू के बाद टीका, Resuspended गोली और बैक्टीरियल मात्रा का ठहराव के लिए एम एंड एम विधि द्वारा उपयोग युक्त STGG से 10 μl हटा. NW ट्यूब STGG का एक और 800 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से. प्लेट एक रक्त अगर थाली और एक चॉकलेट अगर प्लेट पर 25 μl पर 25 μl, पूरी थाली streaking. शेष राशि -80 पर 2 cryovials और दुकान में मध्यम STGG में निलंबित कर दिया बैक्टीरिया फूट डालो ° सी. 37 प्लेटें 5% सीओ 2 ° C रातोंरात सेते हैं. प्लेटें pneumococcus और अन्य संभावित श्वसन रोगज़नक़ों के लिए अगले दिन जांच करते हैं. Pneumococci प्लेटों पर कॉलोनी आकारिकी द्वारा की पहचान कर रहे हैं. प्रारूपकार आकारिकी के साथ अल्फा रक्तसंलायी कालोनियों रक्त अगर एक optochin डिस्क के साथ पर उप सुसंस्कृत और रातोंरात incubated. प्रकल्पित न्यूमोकोकल कालोनियों कि optochin संवेदनशील ग्राम ग्राम सकारात्मक diplococci की पुष्टि करने के लिए दाग रहे हैं और Statens सीरम Institut टायर का उपयोग serotypedmotest लेटेक्स किट.

Representative Results

हम 159 लोगों के अनुभव inoculating है, जिनमें से 35 pneumococcus किए गए. सबसे कम खुराक हम सीरोटाइप 6B का उपयोग कर के साथ गाड़ी हासिल Naris 11,100 CFU/100 प्रति μl था, उच्चतम खुराक Naris 313.000 CFU/100 प्रति μl था. सबसे कम खुराक हम सीरोटाइप 23F का उपयोग कर के साथ गाड़ी हासिल Naris 9000 CFU/100 प्रति μl था, उच्चतम खुराक Naris 84,500 CFU/100 प्रति μl था. गाड़ी मूल्यांकन की हमारी विधि एक नाक धोने, चुना क्योंकि हाल ही में एक 10 अध्ययन से पता चला है कि स्वयंसेवकों के 91% नाक धोने nasopharyngeal झाड़ू से अधिक आरामदायक हो पाया है, नाक धोने भी अधिक सूक्ष्मजीवविज्ञानी संस्कृति का उपयोग रोगज़नक़ों का पता लगाने की संभावना है. माइक्रोबियल रक्त अगर NW साथ inoculated प्लेटों पर बरामद वनस्पति चर और पढ़ने के लिए मुश्किल हो सकता है. Gentamicin pneumococcus के लिए चयन करने के लिए 1 रक्त अगर प्लेट पर प्रयोग किया जाता है. चॉकलेट अगर थाली और 2 रक्त अगर प्लेट अन्य संभावित श्वसन पथ का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता हैogens जो मदद या न्यूमोकोकल उपनिवेश की स्थापना में बाधा हो सकती है. एक रक्त अगर NW साथ inoculated थाली है कि पढ़ने के लिए आसान है की एक उदाहरण चित्रा 1a में दिखाया गया है, एक मुश्किल वनस्पति के कई प्रकार युक्त थाली चित्रा 1b में दिखाया गया है. हर नियुक्ति स्वयंसेवकों के लिए किसी भी ऊपरी श्वास पथ के लक्षण का वर्णन करने के लिए पूछा गया, अगर वर्तमान, और वाहक और गैर वाहक के बीच तुलना पर प्रकाश डाला गया है. 145 लोगों को हाल ही में pneumococcus साथ inoculated के 28 लक्षण (1 टेबल) की शिकायत की. इनमें से आठ वाहक, नहीं थे बीस थे. सबसे आम लक्षण गैर विशिष्ट नाक लक्षण (1 टेबल) थे. मामलों में बुखार और / या अस्वस्थता सहित प्रणालीगत लक्षण, सूचित किया गया, किए गए जांच के कोई भी पता चला है न्यूमोकोकल रोग और लक्षण के सबूत टॉन्सिल्लितिस के एक मामले में अलावा समवर्ती वायरल संक्रमण के साथ संगत कर रहे थे. दो न्यूमोकोकल positivई स्वयंसेवकों एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज किया गया. एक गले में खराश और कान में दर्द की शिकायत की और अध्ययन डॉक्टर के साथ बैठक करने के बाद, एक एहतियात के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं को लेने की सलाह दी थी. अन्य स्वयंसेवक चिकित्सकीय tonsillitis के साथ का निदान किया गया था. सभी स्वयंसेवकों लक्षणों की तेजी संकल्प किया था. चित्रा 1. रक्त अगर प्लेट NW साथ inoculated रक्त अगर NW साथ inoculated प्लेटों को पढ़ने के लिए मुश्किल हो सकता है. 1a एक प्लेट है कि स्पष्ट रूप से दिखाई दे pneumococci के साथ पढ़ने के लिए आसान है की एक उदाहरण है. 1b इसे और अधिक बनाने सह बस्तियां वनस्पति के बहुत सारे के साथ एक प्लेट है मुश्किल पता लगाने अगर pneumococci मौजूद है. लक्षण कैरिज (n = 32) कोई कैरिज (n = 112) सबलक्षण 24% 18% प्रणालीगत बुखार 3% 4% अस्वस्थता * 9% 4% स्थानीय कान 9% 3% नाक 0 10% गला 12% 3% तालिका 1. एस स्वयंसेवक की विशेषता के बाद लक्षणों की सूचना निमोनिया 6B टीका सभी शिकायतों बाहरी सुरक्षा समिति द्वारा समीक्षा की गई और पूर्ण जांच के बाद, कोई लक्षण नहीं न्यूमोकोकल रोग के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है. सबसे आम लक्षणों में गले में खराश थी, नाक और फ्लू जैसी बीमारी भरवां.

Discussion

EHPC मंच एक mucosal टीका मॉडल के रूप में और उपन्यास प्रोटीन टीकों का परीक्षण करने के लिए सुरक्षा की एक किराए के रूप में उपयोग सहित क्षमता का उपयोग करता है की एक संख्या है. विधि एक लगातार टीका तकनीक और एक उच्च गुणवत्ता एनडब्ल्यू पर निर्भर है.

Reproducibility inoculum के साथ एक मुद्दा हो सकता है. फ्रोजन बैक्टीरियल aliquots के चर स्वभाव के कारण, यह कठिन हो वांछित खुराक को दोहराने कर सकते हैं. संयोग या इच्छित खुराक के दोहरीकरण सीमा के भीतर माना जाता है. यह महत्वपूर्ण है कि बैक्टीरियल मात्रा का ठहराव तुरंत करने के लिए और पूर्व निम्नलिखित टीका किया जाना है, के क्रम में सही CFU गिनती से जीवाणुओं की मात्रा का ठहराव निर्धारित. इस कारण के लिए यह उपयोगी हो अगर स्वयंसेवक नियुक्तियों होते साथ इतनी है कि हो सकता है कि केवल एक inoculum और तैयार रहने की जरूरत है और मात्रा का ठहराव से पहले और बाद में टीका किया चढ़ाना कोई भी अधिक 30 मिनट के अलावा होता है.

NW विधि coope की आवश्यकतास्वयंसेवक और राशन के बच्चों में एक आदर्श तरीका नहीं होगा. अगर उपज कम से कम 5 मिलीग्राम है, प्रक्रिया एक अतिरिक्त 20 मिलीलीटर तक का उपयोग दोहराया जा सकता है. पहने डेन्चर NW उपज को कम कर सकते हैं. अगर स्वयंसेवक एक अवरुद्ध / भीड़भाड़ नाक है और खारा प्रविष्टि के बाद पूर्व से बाहर चल रहा है, नाक झटका, एक छोटे से आगे सिरिंज वापस सम्मिलित करने के लिए, और सिर और वापस अगर जरूरत झुकाव.

एनडब्ल्यू एक तकनीक है कि अभ्यास के साथ बेहतर हो जाता है. कुछ मात्रा आमतौर पर इतनी उद्देश्य कम से कम 10 मिलीलीटर की एक वापसी के लिए खो जाएगा. यदि स्वयंसेवक NW दौरान खारा स्वाद कर सकते हैं तो पीछे nasopharynx और oropharynx के बीच संबंध को पर्याप्त रूप से नहीं किया गया है स्वयंसेवक जीभ से बंद कर दिया. यदि स्वयंसेवक खारा के सबसे निगल प्रक्रिया फिर से समझाने, मुँह की छत के खिलाफ जीभ के आगे बढ़ाने पर बल. तो प्रक्रिया को दोहराने के लिए वृद्धि की मात्रा लौटे.

यदि NW एक substant शामिल हैंबलगम की ial राशि, यह सबसे अच्छा है centrifugation से पहले हटाने. भंवर नमूना इतनी के रूप में कुछ भी है कि बलगम करने के लिए बाध्य किया जा सकता है और फिर के रूप में संभव के रूप में बड़े टुकड़े के बहुत दूर है, जबकि संभव के रूप में थोड़ा खारा के रूप हटाने को ढीला करने के लिए.

संयुक्त राज्य अमेरिका में पिछले एक EHPC अध्ययन सुरक्षित रूप से पूरा किया गया और कोई प्रतिकूल ¹¹ घटनाओं की थी. EHPC मंच की निरंतर सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए, हम एक आपातकालीन प्रोटोकॉल जो 24 घंटे अनुसंधान टीम के लिए उपयोग के आसपास आधारित है निर्धारित किया है. स्वयंसेवक संपर्क विवरण दिया जाता है, की अनुमति उन्हें शोध टीम के लिए एक दिन में 24 घंटे का उपयोग. किसी भी चिकित्सा देखभाल की जरूरत रॉयल लिवरपूल विश्वविद्यालय अस्पताल में प्रदान की जाती है. सुरक्षा की एक और उपाय के रूप में, एक सुरक्षा अनुसंधान समूह के बाहर से चिकित्सकों और वैज्ञानिकों से मिलकर समिति एक साप्ताहिक सुरक्षा रिपोर्ट प्राप्त करता है. रिपोर्ट में बैक्टीरियल खुराक प्रत्येक स्वयंसेवक प्राप्त और है कि क्या किसी भी लक्षण या बीमारी सूचित किया गया है. इस रिपोर्ट वें की सुरक्षा की अनुमति देता हैई अध्ययन बाह्य पूर्वाग्रह के बिना critiqued. सुरक्षा समिति भी उपलब्ध हैं 24 घंटे एक आपात स्थिति की संभावना नहीं घटना में एक दिन.

Materials

Name	Company	Cat#
Glycerol	Fisher	G/0650/08
0.9% Sodium Chloride	B. Braun	3627667
Skim milk powder	Fluka	70166
Tryptone soya broth	Becton Dickinson	211768
Glucose	BDH	284504S
Columbia Agar with chocolated horse blood	Oxoid	PB0124
Pneumotest-latex kit	Statens Serum Institut	51823