Vi beskriver en fremgangsmåde til sporing af endomembrane brud fremkaldt af de intracellulære bakterier<em> Shigella flexneri<em></em</em> Og<em<em><em> Mycobacterium tuberculosis</em></em</em> Ved værtscelle invasion. Vores assay gør brug af CCF4, et væld cytoplasmatisk FRET sonde i levende eller faste celler. Denne reporter nedbrydes ved en enzymaktivitet til stede på den bakterielle overflade.
Shigella flexneri er sygdomsfremkaldende bakterier, der invaderer værtsceller indgå en endocytisk vacuole. Efterfølgende brud på denne membran lukkede rum kan bakterierne bevæge sig inden for cytosolen, proliferere og yderligere invadere omkringliggende celler. Mycobacterium tuberculosis fagocyteret af immunceller, og har for nylig vist at sprænges phagosomal membran i makrofager. Vi udviklede en robust assay til sporing phagosomal membransprængning efter værtscelle indtastning af Shigella flexneri eller Mycobacterium tuberculosis. Den fremgangsmåde gør brug af CCF4, en FRET reporter følsom over for β-lactamase, der afbalanceres i cytosolen af værtsceller. Ved invasion af værtsceller ved bakterielle patogener, forbliver proben intakt, så længe bakterierne opholde sig i membran-lukkede rum. Efter afbrydelse af vakuolet, β-lactamase-aktivitet på overfladen af de intracellulære patogener spalter CCF4 straks føreING til et tab af FRET signal og skifte sin emission spektrum. Denne robuste ratiometrisk analyse giver præcise oplysninger om timingen af vacuolær brud induceret af de invaderende bakterier, og det kan kobles til automatiseret mikroskopi og billedbehandling af specialiserede algoritmer til påvisning af emissions signaler FRET donor og acceptor. Endvidere er det muligt at undersøge dynamikken i vacuolær forstyrrelser fremkaldt af intracellulære bakterier i realtid i enkelte celler. Endelig er det særdeles velegnet til high-throughput analyse med spatio-temporale opløsning end tidligere metoder. Her giver vi de eksperimentelle detaljer eksemplariske protokoller for CCF4 vakuolær brud assay på HeLa-celler og THP-1 makrofager til tidsforskudte eksperimenter eller slutpunkter eksperimenter ved hjælp af Shigella flexneri samt multiple mycobakterielle stammer, såsom Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, og Mycobacterium tuberculosis.
Talrige bakterielle patogener internaliseres i membran-lukkede rum i eukaryote celler under deres forløb af infektion. Celleindtastning sker enten gennem fagocytose af specialiserede værtsceller, som det er tilfældet for Mycobacterium tuberculosis, der indtages af makrofager, eller patogener aktivt fremkalde deres optagelse i typisk ikke-fagocytiske celler. I tilfælde af induceret optagelse, for eksempel for Shigella flexneri patogenet tilfører effektor proteiner i værten cytosol der kapre blandt andre cellefunktioner den reguleres stramt endomembrane sortering maskiner resulterer i bakteriel lokalisering inden en endosomale rum 1,2. Efterfølgende Shigella forstyrrer den omsluttende membran fører til vakuolær briste og cytosol adgang af patogenet forstyrre host membran menneskehandel og friholde lysosomet. For nylig er fagolysosomale brud også fundet som infektion strategy brugt af Mycobacterium tuberculosis, et patogen, der var tænkt i lang tid ved udelukkende at blive lokaliseret i en membran-bundet rum 3,17.
For at undersøge dynamikken i subcellulær membran handel med invasive patogener, har store forbedringer er opnået, siden transmissions elektronmikroskopi (TEM) baseret undersøgelser af slutningen af 1980'erne 4,5. For eksempel, fluorescensmikroskopi baserede metoder ved hjælp farvestoffer antistoffer mod bakterielle overflade komponenter eller markører for co-lokalisering med subcellulære rum overtog 6,7. Men de stadig ikke give præcise Spatiotemporal opløsning og robusthed til at måle vakuolær brud ved bakterielle patogener kvantitativt.
Denne hurdle er blevet behandlet med et assay baseret på cephalosporin afledt CCF4-AM FRET reporter, der først blev anvendt til at undersøge genekspression 8.. Derefter blev det brugt i sammenhæng med inffdeling biologi til at undersøge effektor sekretion og følge optagelsen af Neisseria i værtsceller 9,10,11. Vi udviklede en analyse drage fordel af denne reporter for at studere vakuolær brud fremkaldt af Shigella flexneri 12 og Mycobacterium tuberculosis 17.. Princippet om vores fremgangsmåde er beskrevet i figur 1 under anvendelse af Shigella flexneri. Først værtsceller fyldt med FRET CCF4-AM substrat, der er fanget inde i cytoplasmaet efter fraspaltning AM estergrupper. Derefter blev celler inficeret med Shigella flexneri. β-lactamase til stede på overfladen af bakterierne er i stand til at spalte CCF4 substrat snarest vacuolær brud forekommer. Dette fører til et tab af FRET signal skifte emission top fra 535 nm til 450 nm ved excitation af sonden ved 405 nm. Den ratiometriske måling af de 450/535 nm intensiteter fremhæver vakuolær integritet: lave nøgletal afspejler membran-enlukkede eller ekstracellulære bakterier mens høje forhold afspejler kontakt mellem bakterier og værten cytosol. Vi rapporterer også en tilpasning af denne metode til at studere phagosomal brud fremkaldt af Mycobacterium tuberculosis i THP-1 makrofager. De eksperimentelle principper forbliver de samme, selv om rækkefølgen er omvendt, CCF4-AM loading kun anvendes efter bakteriel infektion.
Således ved kvantitative ratiometrisk fluorescens målinger på enkelt celle niveau, kan vakuolær brud på Shigella flexneri spores i realtid og i faste prøver fra forskellige celletyper 12,13,14. Desuden kan denne fremgangsmåde tilpasses til en række andre invasive patogener, som vist i denne undersøgelse med Mycobacterium bovis og Mycobacterium tuberculosis. Endelig miniaturisering af vores protokol til 96 godt (eller 384 brønde) formater tillader screening af en lang række forhold på high throughput.
Den CCF4-AM/β-lactamase assayet er en enkel metode til at spore vacuolær forstyrrelser fremkaldt af intracellulær Shigella flexneri og mycobakterier i forskellige celletyper. Det gør brug af en lactamase følsom cytoplasmatisk FRET reporter, der spaltes af et enzym aktiv på overfladen af bakterierne.
Tab af CCF4-AM substrat kan let undgås ved at tilføje probenecid til alle løsninger efter lastning af underlaget. Som påvist, kan analysen tilpasses til flere celletyper (epitelceller, fagocytiske celler) og formater (96 brønde, 35 mm glasbund retter, 6/12/24 brøndsplader). Til brug for den 6/12/24 brønds plade, er sterile dækglas fordelt i bunden af hver brønd, før podning af cellerne. Ved afslutningen af forsøget, er dækglas overføres på objektglas ved montering medium, såsom Forlæng Guld antiblegemiddel Reagent (Invitrogen). Denne måde signalet er stabilt i længere tidsperioder efter assayetsammenlignet med 96 brønde format, hvor prøver opbevares i PBS efter fiksering. Den høje pris på den CCF4-AM substrat bør tages i betragtning, før bestemmelsen af prøvevolumenet. Det er derfor, vi anbefaler, opskalere dem ned. Eksperimenter er dyrere i 6/12/24 godt format, men signalerne er stabile i dagevis. Tværtimod er eksperimenter billigere i 96 brønds format, men prøver skal analyseres på dagen for eksperimentet. Det er bemærkelsesværdigt, at levende eksperimenter kan også udføres ved 96 brønd eller 384 brønde format. Dette gør det muligt at udføre levende eksperiment med snesevis af forholdene på samme tid (mutant bakterier, MOI, plasmid eller siRNA transfektion, kemikalier osv.) med antallet af positioner per brønd. Selvom velegnet til Shigella flexneri, vi understrege, at "sande" realtid eller time-lapse forsøg, der ikke er muligt for mykobakterier studier da infektionen cyklus overstiger målbare koncentrationer af CCF4 der kan tilbageholdes i cytosolen. Fordenne grund er det CCF4-AM substrat anvendt på celler efter invasionen er opnået.
I tilfælde MetaMorph software bruges til indsamling og analyse, anbefaler vi at bruge modulet "skærm køb", som giver erhverve en hel 96/384 brønde med et bestemt antal billeder per godt. Endvidere modulet "anmeldelse skærmdata" giver (i) at visualisere syet billede mosaik af hver brønd for enhver kanal på samme tid på en stor "plakat", og (ii), looping en specialiseret algoritme til at måle intensiteten i 535 og de 450 nm kanaler. Selv om vi har været i stand til at måle vakuolær brud med enkelte bakterier ved time-lapse mikroskopi, vil vi gerne advare om, at den enzymatiske aktivitet på overfladen af de enkelte bakterier varierer gør det vanskeligt præcist at korrelere antallet af intracellulære bakterier og effektiviteten af vacuolær brud.
Givet robustheden af assayet er det velegnet til hIGH gennemløb nærmer i 96 eller 384 vel formater. Vi har også med held tilpasset denne protokol for FACS-analyse til at studere infektion af celler i suspension 16. Assayet kan også anvendes til undersøgelse af andre bakterier eller bærere præsenterer lactamase på deres overflade, hvilket fører til en lang række applikationer. For eksempel kan denne fremgangsmåde anvendes til at studere vacuolær brud fremkaldt af andre patogener, såsom β-lactamase udtrykker Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes eller Salmonella typhimurium 12. Da Listeria monocytogenes har en kort infektion cyklus kan sammenlignes med Shigella flexneri, time-lapse eksperimenter er mulige. I modsætning hertil Legionella pneumophila og Salmonella typhimurium display lange infektion cyklusser, fordi vi foreslår at udføre slutpunkt eksperimenter.
De mange forskellige mulige anvendelser gør CCF4-AM/β-lactamase assay eninteressant fluorometrisk metode til sporing vakuolær brud fremkaldt af intracellulære patogener i faste prøver, eller i realtid.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af Agence Nationale pour la Recherche og Det Europæiske Forskningsråd.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in – 80 ° aliquots |
Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
Probenecid | Sigma | P8761 | |
β-lactamase | Sigma | P0389 |