Mesures rigidité en flexion des biopolymères en utilisant des essais de vol à voile

Résumé

Procédé pour mesurer la longueur de persistance ou la rigidité en flexion de biopolymères est décrit. La méthode utilise une kinésine axée sur les microtubules glisse test pour déterminer expérimentalement la longueur de persistance des microtubules individuels et est adaptable à l'actine des essais à base de glisse.

Résumé

Les microtubules sont des polymères du cytosquelette qui jouent un rôle dans la division cellulaire, mécanique cellulaire et le transport intracellulaire. Chacune de ces fonctions nécessite microtubules qui sont raides et droites assez pour couvrir une fraction significative du diamètre cellulaire. En conséquence, la longueur de persistance des microtubules, une mesure de rigidité, a été activement étudiée pour les deux dernières décennies ^1. Néanmoins, des questions restent ouvertes: microtubules courts sont 10-50 fois moins rigide que les microtubules longues ^2-4, et même microtubules longs ont mesuré la longueur de persistance qui varient d'un ordre de grandeur ^5-9.

Ici, nous présentons une méthode pour mesurer la longueur de persistance des microtubules. La méthode est basée sur une analyse axée sur la kinésine microtubules glisse ^10. En combinant rares marquage fluorescent des microtubules individuels avec suivi de particule unique de fluorophores individuelles attachées à des microtubules, le Glidintrajectoires g de microtubules simples sont suivis du nanomètre-niveau de précision. La longueur de persistance de la trajectoire est la même que la longueur de persistance de l'microtubules dans les conditions utilisées ^11. Un sous-programme de suivi automatisé est utilisé pour créer des trajectoires des microtubules à partir de fluorophores liés aux microtubules individuels, et la longueur de persistance de cette trajectoire est calculée à l'aide des routines écrites en langage IDL.

Cette technique est rapidement réalisable, et capable de mesurer la longueur de persistance de 100 microtubules dans un jour de l'expérimentation. La méthode peut être étendue pour mesurer la longueur de persistance sous une variété de conditions, y compris la durée de persistance en fonction de la longueur le long des microtubules. En outre, les routines d'analyse utilisés peuvent être étendus à la myosine à base de tests effet de glisse, pour mesurer la longueur de persistance des filaments d'actine ainsi.

Introduction

Le cytosquelette, un réseau de biopolymères présent dans la plupart des cellules eucaryotes, joue un rôle dans l'organisation cellulaire, le transport intracellulaire et la mécanique cellulaire. Les caractéristiques mécaniques des biopolymères du cytosquelette (principalement l'actine et les microtubules) jouent un rôle important dans la détermination des caractéristiques mécaniques de la cellule dans son ensemble¹². Puisque la mécanique de la cellule entière permet de caractériser les cellules saines et malades^13,14 et est impliquée dans la motilité cellulaire¹⁵, les propriétés mécaniques des composants cytosquelettiques sous-jacents ....

Protocole

1. Microtubules vol à voile Assay Solutions mères

Préparer à l'avance de dosage glisse.

1. Polymériser 0,5 mg microtubules peu marquées avec un fluorophore organique lumineuse ^22. La concentration étiquette cible est de 1 fluorophore par micromètre de microtubules, soit une densité étiquetage d'environ 1 fluorophore par 1.500 dimères de tubuline. Entreposer à la température ambiante, la lumière protégée avec de l'aluminium, une feuille pour un maximum de deux semaines.
2. Purifier biotine-kinésine ²¹ à environ 1 uM. Conserver à -80 ° C en 5 aliquotes pour utilisation dans des expériences in....

Résultats

Une image extraite d'un test de glissement est présentée dans la Figure 2. Une densité adéquate de microtubules correspond à 1-10 microtubules par champ observé ; une densité nettement plus élevée entraînera des erreurs de suivi lorsque les microtubules se croisent. Un graphique représentant les trajectoires de 11 microtubules issues du test de glissement de la Figure 2 est montré dans la Figure 3. Les trajectoires typiques ont une longueur de 10 à 30 μm ; certaines traj.......

Discussion

Les mesures de longueur de persistance sont une bonne caractérisation des propriétés mécaniques des biopolymères individuels. Dans cet article, nous avons décrit une méthode de mesure de la longueur de persistance des microtubules. Comme indiqué dans l'introduction, cette méthode est facilement étendu à l'examen des propriétés mécaniques des microtubules dans une variété de conditions tout simplement en faisant varier les réactifs, la température, la viscosité ou à l'étape finale de l'épreuve de glisse, .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs
imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
chlorure de potassium	Sigma-Aldrich	P9541
chlorure de magnésium	Sigma-Aldrich	M8266
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
BSA	Calbiochem	126615
biotinylé BSA	Thermo Scientific	29130
&alpha ;-caséine	Sigma-Aldrich	C6780
streptavidine	Thermo Scientific	21125
dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
paclitaxel	LC Laboratories	P-9600
glucose oxydase	Sigma-Aldrich	G2133
catalase	Sigma-Aldrich	C100
glucose	Sigma-Aldrich	G8270
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
2-mercapt– ; thanol	Sigma-Aldrich	M3148	Toxique. Achetez une petite quantité.
24X60 mm N° 1 1/2 verre de protection	VWR	48393-252
22X22 mm N° 1 verre de protection	Gold Seal	3306
Graisse sous vide poussé	Dow-Corning	NA
Equipment
microscope TIRF	many	NA	Le microscope TIRF utilisé dans cette méthode était fait maison.
IDL (logiciel)	Exelis	NA	Pourrait remplacer MATLAB, ImageJ ou d’autres logiciels d’analyse d’images.