Het verzamelen van en het meten van wondexsudaat Biochemische Mediators In chirurgische wonden

Summary

Dit artikel geeft een gedetailleerde en visuele beschrijving van een methodologie voor het verzamelen en meten van biochemische inflammatoire en nociceptieve bemiddelaars op de chirurgische wond na keizersnede. Deze menselijke bioassay werd gebruikt om correlaties tussen wond en serum cytokine concentraties en drug-gemedieerde veranderingen in wond cytokines, chemokines en neuropeptiden bepalen.

Abstract

We beschrijven een methode waarmee we kunnen verzamelen en biochemische inflammatoire mediatoren en nociceptieve meten op de chirurgische wond. Het verzamelen van site-specifieke biochemische markers belangrijk om te begrijpen van de relatie tussen niveaus in serum en chirurgische wond vast die associaties tussen mediatorafgifte, pijn, pijnstillend gebruik en andere uitkomsten van belang, en evalueren van het effect van systemische en perifere toediening van het geneesmiddel op chirurgische wonden biochemie. Deze methodologie is toegepast op gezonde vrouwen die een electieve keizersnede met spinale anesthesie. We hebben gemeten wondexsudaat en serum mediators op dezelfde tijdsintervallen als pijnpatiënt scores en analgetica verbruik tot 48 uur na keizersnede. Met deze methode hebben we verschillende biochemische mediatoren waaronder nerve growth factor (NGF), prostaglandine E2 (PG-E2) substance P, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7 detecteren, IL-8,IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFa, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 en MIP-1β. Studies van dit menselijk wond bioassay hebben geen correlaties tussen wond en serum cytokine concentraties of de time-afgifteprofiel (J Pain 2008;. 9 (7) :650-7) ¹ wij gedocumenteerd de bruikbaarheid van de techniek te identificeren. drug-gemedieerde veranderingen in de wond cytokine-inhoud (Anesth Analg 2010; 111:1452-9). ²

Introduction

Na een chirurgische incisie, verblijvende en migrerende ontstekingscellen vrij pro-en anti-inflammatoire cytokines, prostanoïden, neuropeptiden en chemokines die belangrijk zijn voor het initiëren en onderhouden pijn. ^3,4 De mogelijkheid om site-specifieke biochemische markers verzamelen is essentieel voor het bepalen tussen niveaus in serum en chirurgische wond begrijpen complexe relatie tussen mediatorafgifte en chirurgische pijn en kunnen het effect van zowel systemische als perifere toediening evalueren operatiewond biochemie. Studies gericht op systemische metingen van biochemische mediators en niet als plaats-specifieke afgifte. ^5,6 Serum metingen van cytokines en chemokines hoeft niet representatief voor lokale operatiewond biochemische gebeurtenissen en slechts dan een globale systemische reactie op chirurgische letsel. Dit artikel geeft een gedetailleerde en unieke visuele beschrijving van deze methodiek dat was sparst waarnaar verwezen wordt in 2008 in de Journal of Pain. ¹ Het doel van deze Jove artikel is om een unieke en visueel verbeterde beschrijving van de methoden.

Protocol

1. Studie protocol

• Verkrijgen van Institutional Review Board goedkeuring en schriftelijke informed consent.
• Selecteer een geschikte chirurgische populatie voor onderzoek uit te voeren. Deze methodologie is alleen van toepassing op keizersnede wonden, maar de meeste chirurgische wonden passend zou zijn.
• Overweeg in-en exclusiecriteria voor uw deelname aan het onderzoek. Patiënten en procedures met hoge tarieven van chirurgische wondinfectie wellicht niet geschikt.
• Standaardiseren anesthesie en postoperatieve behandeling voor alle patiënten om potentiële confounders te voorkomen.

2. Nociceptieve en inflammatoire Biochemische Middelaar Collection

• Plaats de ON-Q PainBuster met ON-Q SilverSoaker (I-Flow, Lake Forest, CA) in de onderhuidse laag vlak voor sluiting (andere weefsellagen kan worden beschouwd) gewikkeld. De ON-Q PainBuster Pain Relief System levert continu fysiologisch zout met een snelheid van 2 ml / uur. De drager kan kamINED met of tegen drugs van belang, zoals een lokaal anestheticum en niet-steroïdale anti-inflammatoire middelen.
• Voorzien van een standaard driewegkraan in dit systeem om aspiratie van wondvocht kan op bepaalde tijdstippen. De continue infusie catheter voorkomt stolling en verbetert de betrouwbaarheid van het systeem om exsudaat monsters. Als aspiratie van exsudaat is moeilijk (ongeveer 5% van de gevallen), kunt u overwegen te duwen zachtjes boven de wond, het veranderen van het onderwerp positie (bijvoorbeeld, zitten de patiënt omhoog of liggend ze plat), met behulp van een 0,5-1 ml normale fysiologische zoutoplossing spoelen of intrekking van de katheter 1-2 cm.
• Op tijdstippen bepaald door het protocol (bijvoorbeeld, 1, 4, 6, 24, en 48 uur na de keizersnede), zuigen en trekken 1 ml wondvocht. Breng het exsudaat in een polyethyleen cup met 30 ul proteinase inhibitor. We hebben gebruikt Compleet Proteinase Inhibitor (Roche Bioscience, Palo Alto, CA) voor onze doeleinden.
• Binnen 1 uur van het verzamelen, zet monsters op ijs en gecentrifugeerd bij 3000 rpm gedurende 10 minuten.
• Verwijder serum en wond bovenstaande vloeistof en doe dit in een standaard microcentrifugebuis en bewaar bij -20 ° C.

3. Assay Analyse

• Zodra alle studie exsudaat en serummonsters worden verzameld en opgeslagen, ontdooien en analyse van deze monsters tegelijk.
• We hebben gemeten cytokines en chemokines met een multiplex immunoassay. De multiplex immuno-assay techniek laat ons toe assay vele analyten van kleine (50 pl) volumemonsters. De multiplex produceren resultaten vergelijkbaar met deze van ELISA. We hebben de 17-plex Bio-PlexTM systeem (BioRad, Hercules, CA) voor de analyse. Deze test kan meten tumor necrosis factor α (TNFa), interferon α (INFα), interleukine 1β (IL-1β), interleukine 2 (IL-2), interleukine-4 (IL-4), interleukine 5 (IL-5 ), interleukine 6 (IL-6), interleukine 7 (IL-7), interleukine 8 (IL-8), interleukine (IL-10), interleukine 12 (IL-12), interleukine 13 (IL-13), interleukine 17 (IL-17), granulocyt kolonie stimulerende factor (G-CSF), granulocyt-macrofaag kolonie stimulerende factor (GM-CSF), monocyt chemoattractant eiwit 1 (MCP-1) en macrofaag ontstekingsproteïne 1 (MIP-1β). Nerve growth factor werd gemeten met NGF DY256 antilichaam toe te voegen aan de 17-plex plaat met de Bio-Plex amine koppeling kit.
• Om een ​​goede analyse van de kwaliteit te garanderen, moeten elke meting worden uitgevoerd in tweevoud. Standaardcurven voor elk analyt zijn gegenereerd met verwijzing analyten door de fabrikant (bij concentraties van 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3.200 pg / ml pluseen nul standaard voor de fysiologische zoutoplossing). Standaard curven worden opgenomen in elke run en concentraties in het monster worden berekend met Bio-Plex Manager-software.
• Substance P en prostaglandine E2 werden gemeten met behulp van zeer gevoelige ELISA kits. We hebben gebruikt Assay Designs, Inc (Ann Arbor, Michigan) voor deze analyse. Analyses uitvoeren in tweevoud volgens specificatie van de fabrikant.

Representative Results

Met deze methode hebben we kunnen alle biochemische mediators hierboven beschreven, met uitzondering van IL-5 in wondexsudaat en plasma gedetecteerd. ^1,2 Enkelen cytokines werden niet gedetecteerd in plasma (IL-4, IL-17, TNFa, INFγ , GM-CSF). ¹ Het tijdsverloop van de gemeten cytokines en chemokines in de gerapporteerde studies consistent waren, het bereiken van een plateau in de eerste uren dat werd volgehouden voor de 24 uur observatieperiode .. ^1,2 Echter, NGF gestaag toegenomen in de 24 uur verzamelperiode, dat PGE2 piek binnen 1 uur en vervolgens geleidelijk afneemt. ^een bijzonder opmerkelijke resultaten zijn aanzienlijk verlaagde niveaus van IL-10 en niveau van substance P verhoogd wonden ingeprent met de plaatselijke verdoving bupivacaine, compatibel met een totale pro- inflammatoire effect van het geneesmiddel (figuur 1). ² In een ander onderzoek toonden wij aan dat analgetische consumptie na keizersnede delivery operatie was negatief gecorreleerd met wondvocht IL-6, IL-1 β, en G-CSF concentraties (Figuur 2). ^een

Figuur 1. Interleukine-10 (IL-10) en substantie P wondvocht niveaus niveaus (pg / ml) gemeten op 1, 3, 5, 7 en 24 uur na keizersnede. De normale zoutoplossing groep wordt in grijs aangegeven diamanten, en de bupivacaïne groep wordt weergegeven met zwarte vierkantjes. * = Significant verschillend tussen de groepen (P <0,005).

Figuur 2. Correlatie tussen interleukine-6 ​​(pg / ml) en morfine verbruik in de eerste 24 uur na keizersnede.

Discussion

Deze methodologie hierboven beschreven is gebleken is gevoelig genoeg om biochemische inflammatoire mediatoren en nociceptieve detecteren wondvocht. Bemonstering op verschillende tijdstippen heeft ook ons toegestaan ​​om veranderingen van deze mediatoren in de tijd. ^1,2 Wij zijn niet op de hoogte van andere menselijke operatiewond test die serieel kan meten het afgifteprofiel van inflammatoire en nociceptieve mediatoren in chirurgische wond exsudaat te observeren. Resultaten van onze methodiek wondexsudaat collectie van de chirurgische incisie verschilt van studies gebruik afvoeren van de heup, hetgeen suggereert dat ^7,8 subcutane wond mediatorafgifte afwijken van intra-articulaire of andere lichaamsholten biochemische mediatorafgifte. Bovendien kunnen resultaten in buizen worden verstoord door bloedverlies in de wond, en daarom mogelijk niet nauwkeurig weergegeven lokale biochemische mediatorafgifte.

De slechte correlatie tussenwond en serumspiegels toont het belang van het bepalen van site-specifieke versie bij het bestuderen van chirurgische wonden. Lokale wijzigingen niet systemisch worden gereflecteerd door vele factoren, waaronder differentiële systemische en lokale productie in respons op chirurgisch trauma en stress. Ook al hebben we een specifieke selectie van pro-en anti-inflammatoire cytokines en chemokines en NGF, SP en PG-E2 van keizersnede wondexsudaat, ^1,2 deze methode kan worden toegepast op andere chirurgische modellen en vele andere maatregelen biochemische bemiddelaars.

Operatiewond plaatselijke verdoving instillatie is een gebruikelijke techniek om postoperatieve pijn. ⁹ toepassing van de methode, hebben we dat plaatselijke verdoving instillatie aantonen in chirurgische wonden heeft wond biochemie beïnvloeden. ² Een afname in IL-10 en de toename van substance P in wondvocht met bupivacaïne instillatie suggereert een verstoring of anti-inflammatoire modulatie. Perifeer toegediend lokale anesthetica kan daardoor invloed hebben op de inflammatoire processen, ^10,11 en kan ten dele voor plaatselijke verdoving-geïnduceerde chondrolysis in gewrichten rekening na de operatie ^12.

ON-Q PainBuster Pain Relief System is een Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) die is goedgekeurd sinds 1998 dat wordt gebruikt voor de levering van lokale anesthetica op de chirurgische wond om pijn te verminderen na een operatie. Continu wond instillatie gebruik te maken van deze en andere katheters is niet geassocieerd met een verhoogd wondinfectie. ^9,13 OP-Q PainBuster met ON-Q SilverSoaker is ontworpen om drugs trekken en niet herhaaldelijk te proeven wondvocht. Hoewel we hadden geen wondinfecties met deze techniek, hebben we benadrukken van een aseptische techniek, terwijl de bemonstering wondvocht van dit systeem. Onze voorgestelde wijziging van de monsterneming te vergemakkelijken moet worden gereserveerd voor onderzoeksdoeleinden en niet voor routine klinische use. Wij raden ook aan dat de duur van de katheter blijft in-situ worden beperkt tot 48-72 uur.

Deze operatieplaats bioassay verschaffen een goed model om de relatie tussen inflammatoire mediatoren en nociceptieve biochemische in postoperatieve pijn te begrijpen. We zullen gebruik maken van de methodologie in toekomstige studies naar de effecten van lokaal toegediende niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen en opioïden te onderzoeken. De techniek kan ook leent voor onderzoek het onderzoek wondgenezing, overmatige chirurgische littekens en wondinfectie.