Isolasjon og Kv Channel Recordings i Murine Atrial og ventrikulær cardiomyocytes

Summary

Kv kanal dysfunksjon er assosiert med hjertearytmier. For å studere molekylære mekanismer som fører til slike arytmier vi utnytter en systematisk protokoll for isolering av atrie og ventrikkel cardiomyocytes fra Kv kanal hjelpeutstyr subenheten knockout mus. Isolerte cardiomyocytes kan deretter brukes umiddelbart for mobilnettet elektrofysiologiske studier, biokjemiske eller immunfluorescens (IF) analyser.

Abstract

KCNE genene koder for en liten familie av Kv kanal hjelpeutstyr subenheter som danner heteromeric komplekser med Kv kanal alpha subenheter å endre sine funksjonelle egenskaper. Mutasjoner i KCNE gener har blitt funnet hos pasienter med hjertearytmier som lang QT-syndrom og / eller atrieflimmer. Imidlertid gjenstår det nøyaktige molekylære patofysiologien som fører til disse sykdommene unnvikende. I tidligere studier de elektrofysiologiske egenskaper sykdomsfremkallende mutasjoner i disse genene har stort sett blitt studert i heterologe uttrykk systemer, og vi kan ikke være sikker på om de rapporterte effektene kan direkte oversettes til innfødte cardiomyocytes. I vårt laboratorium derfor vi bruker en annen tilnærming. Vi direkte studere effekten av KCNE genet sletting i isolerte cardiomyocytes fra knockout mus ved mobilnettet elektrofysiologi – en unik teknikk som vi beskriver i dette nummer av Journal of visualisert Experiments. Hjertene fra Genetically konstruert KCNE mus raskt fjernet og montert på en Langendorff apparat aortic kanylering. Gratis Ca ^{2 +} i hjertemuskelen er bundet av EGTA, og dissosiasjon av hjerte myocytes blir så oppnås ved retrograd perfusjon av koronararteriene med en spesialisert lav Ca ^{2 +} buffer som inneholder collagenase. Atria fri rett ventrikkel vegg på venstre ventrikkel kan deretter bli separert ved mikrokirurgiske teknikker. Kalsium blir deretter langsomt tilsatt tilbake til isolerte cardiomyocytes i en multippel trinn omfattende vaskeprosedyre. Atrielle og ventrikulære cardiomyocytes av sunt utseende med ingen spontane sammentrekninger blir straks utsatt for elektrofysiologiske analyser av patch clamp-teknikk eller andre biokjemiske analyser innen de første 6 timer etter isolasjon.

Protocol

1. Animal anestesi og organstjeling Anaesthetize musen ved intraperitoneal (ip) injeksjon av ketamin (200 mg / kg kroppsvekt) og xylazin (20 mg / kg kroppsvekt). Å anticoagulate injisere 250 IE Heparin ip for å unngå blodpropp og trombedannelse. Vent til dyp narkose er nådd, som er preget av areflexia. For å se etter areflexia, test hornhinnen refleks ved å forsiktig berøre hornhinnen eller testtur refleks av halen knipe. Overfør musen på operasjonsbordet og fikse det i …

Representative Results

Isolering av voksne murine cardiomyocytes fra genmodifisert mus for å studere funksjonen til spesifikke gener av interesse in vitro har blitt et kraftig verktøy for å ytterligere forstå hjertestans patofysiologi. Denne metoden benyttes i dag av bare en liten, men økende antall grunnleggende laboratorier over hele verden. Men kan isolasjon av voksne ventrikulære murine cardiomyocytes være vanskelig og må gjøres grundig og gjentatte av erfarne hender. Figur 1 viser fersk isolerte exempla…

Discussion

Med den økende utvikling av genetisk modifiserte muselinjer å studere hjertefunksjon og kardial patologi relatert til genet sletting er det også en økende interesse i spesialiserte metoder for å studere effektene av den spesifikke genet sletting i vitro. I vårt laboratorium studerer vi rollene til en familie av Kv kanal hjelpeutstyr subenheter på hjertets repolarisering. De KCNE gener utgjør en familie av 5 gener (KCNE1-5) som spiller viktige roller i menneskelig ventrikkel og atrie re…

Materials

Name of the Reagent	Company
Tetrodotoxin	Alomone
4-aminopyridine	ICN Biomedicals
Heteropodatoxin 2	Alomone
Tetraethylammonium	Sigma Chemicals
Collagenase Type 2	Worthington