Isolering og dyrkning af Neonatal Mouse cardiomyocytes

Summary

Primære mus cardiomyocyte kulturer er et af de centrale redskaber til undersøgelse af myofibrillar organisation og funktion. Følgende protokol beskriver isolering og dyrkning af primære cardiomyocytter fra neonatale mus hjerter. De resulterende cardiomyocyte kulturer kan efterfølgende anvendes til en række af biomekaniske, biokemiske og cellebaserede biologiske assays.

Abstract

Dyrkede neonatale cardiomyocytter har længe været anvendt til at undersøge myofibrillogenesis og myofibrillære funktioner. Dyrkede cardiomyocytes giver mulighed for nem undersøgelse og manipulation af biokemiske veje, og deres virkning på de biomekaniske egenskaber spontant slå cardiomyocytter.

Den følgende 2-dages protokol beskriver isolering og dyrkning af neonatale mus cardiomyocytes. Vi viser, hvordan du nemt dissekere hjerter fra nyfødte, adskille hjertevæv og berige kardiomyocytter fra hjertets celle-populationen. Vi diskuterer brugen af ​​forskellige enzym blandinger for celle-dissociation, og deres virkninger på celle-levedygtighed. De isolerede cardiomyocytter efterfølgende kan anvendes til en række morfologiske, elektrofysiologiske, biokemiske celle-biologiske eller biomekaniske analyser. Vi optimeret protokollen for robusthed og reproducerbarhed ved kun kommercielt tilgængelige løsninger, og enzym blander at show lille lot-til-lot variation. Vi henvender os også fælles problemer forbundet med isolering og dyrkning af cardiomyocytes, og tilbyder en bred vifte af muligheder for optimering af isolerings-og dyrkningsbetingelser.

Introduction

De tidligste rapporter for en vellykket dissociation og kultur af gnaver hjerteceller daterer sig tilbage til 1960'erne ^1,2. Selv da Harary og Farley bemærket, at dyrkede cardiomyocytter "kan give et unikt system for undersøgelse af kravene i den periodiske kontraktilitet [og kan] give et middel til at bestemme bidrag af forskellige metaboliske veje for den [bankende] proces". Selvom Harary og Farley isolerede og dyrkede cardiomyocytter fra unge rotter, og den oprindelige protokol er blevet tilpasset og modificeret af mange videnskabsfolk i årenes løb, har den generelle isolation og dyrkning procedure ikke meget forandret. Imidlertid har bedre enzymer ^3, standardiserede opløsninger ^4,5 og tilsætning af reversible kanal og myosin ATPase-inhibitor BDM at beskytte celler under isolationsproceduren ^6-9 væsentligt forbedret celle-udbytte og levedygtighed.

Voksen vs neonatal cardiomyocytes

Kardiomyocytter isolerede og dyrkede fra neonatale mus eller rotter har flere fordele i forhold kulturer af voksne cardiomyocytes. Fremmest proceduren for neonatale mus eller rotte hjerter isolation er lettere og billigere, når der sammenlignes med isolering af cardiomyocytter fra voksne mus eller rotte ^10. Neonatal cardiomyocytes er langt mindre følsomme over for genindførsel i en calcium-holdigt medium efter dissociation, hvilket øger celle-udbytte. En anden stor fordel er, at neonatale mus cardiomyocytes undergår en hurtigere dedifferentiation – redifferentiation cyklus, der typisk resulterer i spontant at slå celler 20 timer efter plating, mens voksne cardiomyocytes kræver typisk pacing at fremkalde kontraktion. Neonatal cardiomyocytes er også lettere transficerbare med liposomal transfektionsfremgangsmåder, mens voksne cardiomyocytes kræver virale vektorer for en vellykket levering af transgene DNA. I modsætning til neonatal cardiomyocytes, kultur af voksne gnavere cardiomyocytes ^11-13 giver mulighed for undersøgelser af myofibrillar nedbrydning og eventuel genetablering af kontraktile apparat. Disse karakteristiske morfologiske ændringer i voksne cardiomyocytes ske over perioder på 1-2 uger. Den dedifferentiation – redifferentiation cyklus er ledsaget af reexpression af fostrets gen-programmet, og dermed efterligne patologiske forandringer observerede i de humane kardiomyopati ^14. En anden fordel af voksne rotte cardiomyocytter over kultur neonatale cardiomyocytter er evnen til kulturen disse celler i lange perioder.

Rotte vs mus cardiomyocytes

Isolationen og kultur af rotte neonatal cardiomyocytter har nogle fordele i forhold der af mus neonatale cardiomyocytter, herunder højere udbytter af levedygtige celler og øget transfektionsfremgangsmåder satser. Men den brede anvendelse af genetisk modificerede musemodeller for hjerte-sygdomme (f.eks </ Em> musklen lim protein knockout mus som model for dilaterede kardiomyopati ¹⁵⁾ har ført til tilpasning af isolation procedure for cardiomyocytes stammer fra neonatale mus. Selvom de protokoller, der anvendes til at isolere neonatale rotter og mus cardiomyocytes er næsten identiske, skal større omhu i udvælgelsen af ​​et passende enzym mix for sidstnævnte. Faktisk neonatale mus cardiomyocytter er generelt mere modtagelige for overspaltning, hvilket resulterer i en reduceret celle-udbytte og levedygtighed. Desuden bør udpladningsdensitet justeres, fordi cardiomyocytter afledt fra neonatale mus er noget mindre i forhold til celler, der stammer fra neonatale rottehjerter.

Med mange anvendelsesmuligheder for undersøgelse af morfologiske, elektrofysiologiske, biokemiske, celle-biologiske og biomekaniske parametre samt for processen med myofibrillogenesis har dyrkede neonatale cardiomyocytter blevet en af ​​de mest alsidige systemer til undersøgelse afhjerte cellefunktioner in vitro. Det første skridt til en vellykket analyse afhænger imidlertid af en nem og pålidelig metode til at isolere neonatale mus cardiomyocytes. Vores protokol trækker sin metode fra mange kilder og er optimeret til reproducerbarhed og robusthed. Vi diskuterer faktorer, der påvirker cardiomyocyte-udbytte og levedygtighed, og giver en bred vifte af muligheder for optimering af isolerings-og dyrkningsbetingelser.

Protocol

Følgende procedure beskriver en to-dages protokol 16,17 til isolering og dyrkning af neonatale mus cardiomyocytes. Alle opløsninger er sterile eller sterilt filtreret. Alle værktøjer er steriliseret ved overfladen sterilisering med 75% ethanol. Bortset fra den oprindelige væv ekstraktion, er alle trin udføres i en steril laminar strømning cellekultur hætte. Denne protokol er beregnet til isolering af neonatale mus hjerter 1-2 kuld (r) – ca 5-14 unger, men kan tilpasses til større kuldstørrelser og r…

Representative Results

Ved hjælp af denne protokol, vi isolerede hjerter fra 8 én dag gammel neonatale mus (figur 1A, 1B, Supplemental Movie S1). Efter vask og hakning hjerter med en saks (figur 1C-1F) blev vævsfragmenter præfordøjet isoleret medium natten over ved 4 ° C med forsigtig omrøring. Efter predigestion (figur 1G), vi overført væv fragmenter i frisklavet fordøjelse medium og inkuberede vævsfragmenter i 20 minutter ved 37 ° C med forsigtig omrøring. Den resulterende cell…

Discussion

Brugen af ​​dyremodeller for at studere hjertesygdomme er blevet standard i kardiovaskulær forskning. Tættere biokemisk karakterisering af disse modeller (dvs. at studere direkte reaktioner hjerteceller til biokemiske eller biomekaniske stimuli) kræver typisk isolering af hjerte væv eller cardiomyocytes. Undersøgelser af fysiologiske reaktioner i hjertet ex vivo (f.eks acetylcholin ⁴⁰ eller i iskæmireperfusion scenarier ⁴¹⁾ generelt udnytte Langendorff-perfunderet hele h…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8	Sigma	B-0753	prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3	Worthington	CLS-2	substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA	e.g. cellgro	25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS	e.g. cellgro	30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+)	e,g, cellgro	21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4	e.g. cellgro	21-022-CV
DMEM high glucose	e.g. cellgro	10-013-CV
M-199	e.g. cellgro	10-060-CV
fetal bovine serum	e.g. cellgro	35-011-CV	cell-culture grade
horse serum	e.g. cellgro	35-030-CV	cell-culture grade
Leibovitz L-155	e.g. cellgro	10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)	Sigma	C-6645	proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine	Sigma	P-6126	chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride	Sigma	I-6501	chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution	Sigma	C-8919	extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution	Advanced BioMatrix	5005-B	alternative to Sigma collagen solution
cell strainer	e.g. Fisherbrand	22363548	appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm	e.g. Fisherbrand	09-719C	for sterile filtration of digestion medium
straight scissors	e.g. Fine Sciences Tools	91460-11
curved scissors	e.g. Fine Science Tools	91461-11
Dumont No. 7 forceps	e.g. Fine Science Tools	91197-00
perforated spoon	e.g. Fine Science Tools	10370-19	optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue	e.g. Gibco	15250-061	live cell staining
Neubauer hemocytometer	e.g. Prosource Scientific	3500	alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	14-432-23
15 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	05-527-90
20 ml syringe	e.g. BD Medical	14-820-19
10 ml serological pipette	e.g. Falcon	357551
30 mm cell culture dish	e.g. Nunc	153066	for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom	MatTek	P35G-0-10-C	for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish	e.g. Nunc	172958	for preplating
Escort III	Sigma	L3037	for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000	Life Technologies, Invitrogen	52887	substitute for Escort III
			Buffers and media: Isolation medium (filter sterilize) 20 mM BDM 0.0125% trypsin in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+) Digestion medium (filter sterilize) 20 mM BDM 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix in L15 medium Plating medium 65% DMEM high glucose 19% M-199 10% horse serum 5% fetal calf serum 1% penicillin/streptomycin Maintenance medium 78% DMEM high glucose 17% M-199 4% horse serum 1% penicillin/streptomycin optional: 1 μM AraC 1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.