Primære mus cardiomyocyte kulturer er et af de centrale redskaber til undersøgelse af myofibrillar organisation og funktion. Følgende protokol beskriver isolering og dyrkning af primære cardiomyocytter fra neonatale mus hjerter. De resulterende cardiomyocyte kulturer kan efterfølgende anvendes til en række af biomekaniske, biokemiske og cellebaserede biologiske assays.
Dyrkede neonatale cardiomyocytter har længe været anvendt til at undersøge myofibrillogenesis og myofibrillære funktioner. Dyrkede cardiomyocytes giver mulighed for nem undersøgelse og manipulation af biokemiske veje, og deres virkning på de biomekaniske egenskaber spontant slå cardiomyocytter.
Den følgende 2-dages protokol beskriver isolering og dyrkning af neonatale mus cardiomyocytes. Vi viser, hvordan du nemt dissekere hjerter fra nyfødte, adskille hjertevæv og berige kardiomyocytter fra hjertets celle-populationen. Vi diskuterer brugen af forskellige enzym blandinger for celle-dissociation, og deres virkninger på celle-levedygtighed. De isolerede cardiomyocytter efterfølgende kan anvendes til en række morfologiske, elektrofysiologiske, biokemiske celle-biologiske eller biomekaniske analyser. Vi optimeret protokollen for robusthed og reproducerbarhed ved kun kommercielt tilgængelige løsninger, og enzym blander at show lille lot-til-lot variation. Vi henvender os også fælles problemer forbundet med isolering og dyrkning af cardiomyocytes, og tilbyder en bred vifte af muligheder for optimering af isolerings-og dyrkningsbetingelser.
De tidligste rapporter for en vellykket dissociation og kultur af gnaver hjerteceller daterer sig tilbage til 1960'erne 1,2. Selv da Harary og Farley bemærket, at dyrkede cardiomyocytter "kan give et unikt system for undersøgelse af kravene i den periodiske kontraktilitet [og kan] give et middel til at bestemme bidrag af forskellige metaboliske veje for den [bankende] proces". Selvom Harary og Farley isolerede og dyrkede cardiomyocytter fra unge rotter, og den oprindelige protokol er blevet tilpasset og modificeret af mange videnskabsfolk i årenes løb, har den generelle isolation og dyrkning procedure ikke meget forandret. Imidlertid har bedre enzymer 3, standardiserede opløsninger 4,5 og tilsætning af reversible kanal og myosin ATPase-inhibitor BDM at beskytte celler under isolationsproceduren 6-9 væsentligt forbedret celle-udbytte og levedygtighed.
Voksen vs neonatal cardiomyocytes
Kardiomyocytter isolerede og dyrkede fra neonatale mus eller rotter har flere fordele i forhold kulturer af voksne cardiomyocytes. Fremmest proceduren for neonatale mus eller rotte hjerter isolation er lettere og billigere, når der sammenlignes med isolering af cardiomyocytter fra voksne mus eller rotte 10. Neonatal cardiomyocytes er langt mindre følsomme over for genindførsel i en calcium-holdigt medium efter dissociation, hvilket øger celle-udbytte. En anden stor fordel er, at neonatale mus cardiomyocytes undergår en hurtigere dedifferentiation – redifferentiation cyklus, der typisk resulterer i spontant at slå celler 20 timer efter plating, mens voksne cardiomyocytes kræver typisk pacing at fremkalde kontraktion. Neonatal cardiomyocytes er også lettere transficerbare med liposomal transfektionsfremgangsmåder, mens voksne cardiomyocytes kræver virale vektorer for en vellykket levering af transgene DNA. I modsætning til neonatal cardiomyocytes, kultur af voksne gnavere cardiomyocytes 11-13 giver mulighed for undersøgelser af myofibrillar nedbrydning og eventuel genetablering af kontraktile apparat. Disse karakteristiske morfologiske ændringer i voksne cardiomyocytes ske over perioder på 1-2 uger. Den dedifferentiation – redifferentiation cyklus er ledsaget af reexpression af fostrets gen-programmet, og dermed efterligne patologiske forandringer observerede i de humane kardiomyopati 14. En anden fordel af voksne rotte cardiomyocytter over kultur neonatale cardiomyocytter er evnen til kulturen disse celler i lange perioder.
Rotte vs mus cardiomyocytes
Isolationen og kultur af rotte neonatal cardiomyocytter har nogle fordele i forhold der af mus neonatale cardiomyocytter, herunder højere udbytter af levedygtige celler og øget transfektionsfremgangsmåder satser. Men den brede anvendelse af genetisk modificerede musemodeller for hjerte-sygdomme (f.eks </ Em> musklen lim protein knockout mus som model for dilaterede kardiomyopati 15) har ført til tilpasning af isolation procedure for cardiomyocytes stammer fra neonatale mus. Selvom de protokoller, der anvendes til at isolere neonatale rotter og mus cardiomyocytes er næsten identiske, skal større omhu i udvælgelsen af et passende enzym mix for sidstnævnte. Faktisk neonatale mus cardiomyocytter er generelt mere modtagelige for overspaltning, hvilket resulterer i en reduceret celle-udbytte og levedygtighed. Desuden bør udpladningsdensitet justeres, fordi cardiomyocytter afledt fra neonatale mus er noget mindre i forhold til celler, der stammer fra neonatale rottehjerter.
Med mange anvendelsesmuligheder for undersøgelse af morfologiske, elektrofysiologiske, biokemiske, celle-biologiske og biomekaniske parametre samt for processen med myofibrillogenesis har dyrkede neonatale cardiomyocytter blevet en af de mest alsidige systemer til undersøgelse afhjerte cellefunktioner in vitro. Det første skridt til en vellykket analyse afhænger imidlertid af en nem og pålidelig metode til at isolere neonatale mus cardiomyocytes. Vores protokol trækker sin metode fra mange kilder og er optimeret til reproducerbarhed og robusthed. Vi diskuterer faktorer, der påvirker cardiomyocyte-udbytte og levedygtighed, og giver en bred vifte af muligheder for optimering af isolerings-og dyrkningsbetingelser.
Brugen af dyremodeller for at studere hjertesygdomme er blevet standard i kardiovaskulær forskning. Tættere biokemisk karakterisering af disse modeller (dvs. at studere direkte reaktioner hjerteceller til biokemiske eller biomekaniske stimuli) kræver typisk isolering af hjerte væv eller cardiomyocytes. Undersøgelser af fysiologiske reaktioner i hjertet ex vivo (f.eks acetylcholin 40 eller i iskæmireperfusion scenarier 41) generelt udnytte Langendorff-perfunderet hele h…
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Prof. emeritus Jean-Claude Perriard og Evelyn Perriard (Swiss Federal Institute of Technology, Schweiz) om indførelse i isolation teknikker til neonatal rotte og mus cardiomyocytes. Vi vil gerne takke professor Ju Chen og professor Sylvia Evans (UCSD, USA) for deres støtte. Arbejde i laboratoriet af EE blev finansieret af en MRC Career Establishment Grant. SL er understøttet af en K99/R00 vej at tildele uafhængighed fra NIH / NHLBI (HL107744). TMM blev understøttet af en postdoc-stipendium fra American Heart Association (11POST7310066).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8 | Sigma | B-0753 | prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47. |
Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | can be substituted with collagenase type II from Worthington |
Collagenase type II3 | Worthington | CLS-2 | substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche |
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA | e.g. cellgro | 25-053-CI | |
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS | e.g. cellgro | 30-002-Cl | |
1x PBS (without Ca2+, Mg2+) | e,g, cellgro | 21-040-CV | |
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4 | e.g. cellgro | 21-022-CV | |
DMEM high glucose | e.g. cellgro | 10-013-CV | |
M-199 | e.g. cellgro | 10-060-CV | |
fetal bovine serum | e.g. cellgro | 35-011-CV | cell-culture grade |
horse serum | e.g. cellgro | 35-030-CV | cell-culture grade |
Leibovitz L-155 | e.g. cellgro | 10-045-CV | |
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride) | Sigma | C-6645 | proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C |
phenylephrine | Sigma | P-6126 | chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
isoproterenol hydrochloride | Sigma | I-6501 | chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C |
0.1% collagen solution | Sigma | C-8919 | extracellular matrix for coating |
3 mg/ml collagen type 1 solution | Advanced BioMatrix | 5005-B | alternative to Sigma collagen solution |
cell strainer | e.g. Fisherbrand | 22363548 | appropriate filter size:40 μm-100 μm |
syringe filter 0.2 μm | e.g. Fisherbrand | 09-719C | for sterile filtration of digestion medium |
straight scissors | e.g. Fine Sciences Tools | 91460-11 | |
curved scissors | e.g. Fine Science Tools | 91461-11 | |
Dumont No. 7 forceps | e.g. Fine Science Tools | 91197-00 | |
perforated spoon | e.g. Fine Science Tools | 10370-19 | optional, for transfer of heart tissue |
Trypan blue | e.g. Gibco | 15250-061 | live cell staining |
Neubauer hemocytometer | e.g. Prosource Scientific | 3500 | alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems |
50 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 14-432-23 | |
15 ml Falcon tubes | e.g. Fisherbrand | 05-527-90 | |
20 ml syringe | e.g. BD Medical | 14-820-19 | |
10 ml serological pipette | e.g. Falcon | 357551 | |
30 mm cell culture dish | e.g. Nunc | 153066 | for standard culture of cardiomyocytes |
30 mm cell culture dish, glass bottom | MatTek | P35G-0-10-C | for live cell imaging with inverted microscope |
10 cm cell culture dish | e.g. Nunc | 172958 | for preplating |
Escort III | Sigma | L3037 | for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000 |
Lipofectamine 2000 | Life Technologies, Invitrogen | 52887 | substitute for Escort III |
Buffers and media:
|