Isolering och odling av neonatala Mus Cardiomyocytes

Summary

Primära mus cardiomyocyte kulturer är en av de centrala verktygen för att utreda myofibrillar organisation och funktion. Följande protokoll beskriver isolering och odling av primära kardiomyocyter från neonatal mouse hearts. De resulte cardiomyocyte kulturer kan därefter användas för en mångfald av biomekaniska, biokemiska och cellbiologiska analyser.

Abstract

Odlade neonatala hjärtmuskelceller har länge använts för att studera myofibrillogenesis och myofibrillära funktioner. Odlade hjärtmuskelceller möjliggör enkel utredning och hantering av biokemiska vägar, och deras effekt på de biomekaniska egenskaperna av spontant slående hjärtmuskelceller.

Följande 2-dagars protokoll beskriver isolering och odling av nyfödda mus cardiomyocytes. Vi visar hur du enkelt dissekera hjärtan från nyfödda, dissociera hjärtvävnad och berika cardiomyocytes från hjärt-cell-populationen. Vi diskuterar användningen av olika enzymblandningar för cell-dissociation, och deras effekter på cell-livskraft. De isolerade kardiomyocyter därefter kan användas för en variation av morfologiska, elektrofysiologiska, biokemiska, cellbiologiska eller biomekaniska analyser. Vi optimerat protokoll för robusthet och reproducerbarhet, genom att endast använda kommersiellt tillgängliga lösningar och enzym blandar att show litet parti till parti variabilitet. Vi vänder oss också vanliga problem i samband med isolering och odling av hjärtmuskelceller, och erbjuder en mängd olika alternativ för optimering av isolerings-och odlingsförhållanden.

Introduction

De tidigaste rapporterna för den framgångsrika dissociation och kultur av gnagare hjärtceller går tillbaka till 1960-talet ^1,2. Även då Harary och Farley märkt att odlade hjärtmuskelceller "kan ge ett unikt system för studier av kraven i den periodiska kontraktilitet [och kan] ge ett sätt att fastställa bidraget av olika metaboliska vägar för [stryk] process". Även Harary och Farley isolerade och odlade hjärtmuskelceller från unga råttor, och det ursprungliga protokollet har anpassats och modifierats av många forskare genom åren, har den allmänna isolering och odling förfarandet inte mycket förändrats. Dock har bättre enzymer ^3, standardiserade lösningar ^4,5, och tillsats av den reversibla kanal och myosin ATPase inhibitor BDM att skydda celler under isoleringsförfarandet ^6-9 signifikant förbättrad cellutbyte och viabilitet.

Vuxen vs neonatal cardiomyocyter

Cardiomyocytes isolerade och odlade från neonatala möss eller råttor har flera fördelar jämfört med kulturer av vuxna hjärtmuskelceller. Främst, är isoleringsförfarandet för neonatal mus-eller råtthjärtan enklare och billigare, jämfört med isolering av kardiomyocyter från vuxen mus eller råtta ^10. Neonatal cardiomyocytes är mycket mindre känsliga för återinförande till en kalciuminnehållande mediet efter dissociation, kraftigt ökar cell-avkastning. En annan stor fördel är att neonatal mus cardiomyocytes genomgå en snabbare dedifferentiering – redifferentiering cykel som oftast resulterar i spontant slående celler 20 timmar efter plätering, medan vuxna cardiomyocytes kräver normalt pacing att inducera kontraktion. Neonatal cardiomyocytes är också lättare transfekterbara med liposomalt transfektion metoder, medan vuxna cardiomyocytes kräver virala vektorer för framgångsrik leverans av transgent DNA. I motsats till neonatal cardiomyocytes, kultur av vuxna gnagare cardiomyocytes ^11-13 möjliggör undersökningar av myofibrillar nedbrytning och slutligen återupprättande av den kontraktila apparaten. Dessa karakteristiska morfologiska förändringar hos vuxna hjärtmuskelceller uppstår under perioder om 1-2 veckor. Den dedifferentiering – redifferentiering cykeln åtföljs av reexpression av fostrets genen programmet och därigenom härma sjukliga förändringar som observerats i humana kardiomyopati ^14. En annan fördel av vuxna råttkardiomyocyter under odlingen av neonatala kardiomyocyter är förmågan att odla dessa celler under längre tidsperioder.

Rat vs mouse kardiomyocyter

Isolering och odling av råttneonatala kardiomyocyter har vissa fördelar jämfört med den hos mus-neonatala kardiomyocyter, inklusive högre utbyten av viabla celler och ökade transfektion hastigheter. Men den breda användningen av genetiskt modifierade musmodeller för hjärtsjukdomar (t ex </ Em> muskel lim protein knockout-mus som modell för dilaterad kardiomyopati ¹⁵⁾ har lett till en anpassning av isoleringsförfarandet för cardiomyocytes härrör från neonatala möss. Trots att de protokoll som används för att isolera neonatal råtta och mus kardiomyocyter är nästan identiska bör större försiktighet iakttas vid val av en lämplig enzymblandning för den senare. Indeed, neonatal mouse kardiomyocyter i allmänhet är mer mottagliga för overdigestion, vilket resulterar i en reducerad cellavkastning och viabilitet. Dessutom bör pläteringen densitet justeras, eftersom kardiomyocyter härledda från neonatala möss är något mindre jämfört med celler som härrör från neonatala råtthjärtan.

Med många användningsområden för utredningen av morfologiska, elektrofysiologiska, biokemiska, cellbiologiska och biomekaniska parametrar samt för arbetet med myofibrillogenesis har odlade neonatala hjärtmuskelceller blivit en av de mest mångsidiga system för att studerahjärtcellfunktioner in vitro. Det första steget till en framgångsrik analys dock, beroende på en enkel och tillförlitlig metod för att isolera neonatal mus cardiomyocytes. Vår protokoll drar sin metodik från många källor och var optimerad för reproducerbarhet och robusthet. Vi diskuterar faktorer som påverkar cardiomyocyte-avkastning och lönsamhet, och ger en mängd olika alternativ för optimering av isolerings-och odlingsförhållanden.

Protocol

Nedan beskrivs en tvådagarsprotokoll 16,17 för isolering och odling av neonatala möss hjärtmuskelceller. Alla lösningar är sterila eller sterilfiltrerades. Alla verktyg är steriliseras genom ytsterilisering med 75% etanol. Med undantag för den första vävnads utvinning, är alla steg utförs i en steril laminärt flöde cellkultur huva. Detta protokoll är avsedd för isolering av neonatal mus hjärtan 1-2 kull (er) – cirka 5-14 valpar, men kan anpassas för större kullstorlek och råtta neonatal ca…

Representative Results

Med hjälp av detta protokoll, isolerade vi hjärtan från 8 en dag gamla neonatala möss (fig. 1A, 1B, Supple Movie S1). Efter tvättning och mals hjärtan med en sax (figurerna 1C-1F), var vävnadsfragment predigested i isoleringsmedium över natt vid 4 ° C med försiktig omrörning. Efter försmältning (figur 1G), överförs vi vävnadsfragment i nybakade matsmältning medium och inkuberas vävnadsfragment för 20 minuter vid 37 ° C under försiktig omrörning. De…

Discussion

Användningen av djurmodeller för att studera hjärtsjukdomar har blivit standard i kardiovaskulär forskning. Närmare biokemisk karakterisering av dessa modeller (dvs. studerar direkta svar av hjärtceller till biokemiska och biomekaniska stimuli) kräver vanligen isolering av hjärt vävnader eller hjärtmuskelceller. Studier som undersöker fysiologiska reaktioner i hjärtat ex vivo (t.ex. för att acetylkolin ^40, eller i ischemi-reperfusion scenarier ⁴¹⁾ i allmänhet utnyttj…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8	Sigma	B-0753	prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 °C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.
Collagenase/Dispase	Roche	10269638001	can be substituted with collagenase type II from Worthington
Collagenase type II3	Worthington	CLS-2	substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche
1x trypsin solution (0.25%) with EDTA	e.g. cellgro	25-053-CI
1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS	e.g. cellgro	30-002-Cl
1x PBS (without Ca2+, Mg2+)	e,g, cellgro	21-040-CV
HBSS (Hank’s balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4	e.g. cellgro	21-022-CV
DMEM high glucose	e.g. cellgro	10-013-CV
M-199	e.g. cellgro	10-060-CV
fetal bovine serum	e.g. cellgro	35-011-CV	cell-culture grade
horse serum	e.g. cellgro	35-030-CV	cell-culture grade
Leibovitz L-155	e.g. cellgro	10-045-CV
AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)	Sigma	C-6645	proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C
phenylephrine	Sigma	P-6126	chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
isoproterenol hydrochloride	Sigma	I-6501	chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 °C or -20 °C
0.1% collagen solution	Sigma	C-8919	extracellular matrix for coating
3 mg/ml collagen type 1 solution	Advanced BioMatrix	5005-B	alternative to Sigma collagen solution
cell strainer	e.g. Fisherbrand	22363548	appropriate filter size:40 μm-100 μm
syringe filter 0.2 μm	e.g. Fisherbrand	09-719C	for sterile filtration of digestion medium
straight scissors	e.g. Fine Sciences Tools	91460-11
curved scissors	e.g. Fine Science Tools	91461-11
Dumont No. 7 forceps	e.g. Fine Science Tools	91197-00
perforated spoon	e.g. Fine Science Tools	10370-19	optional, for transfer of heart tissue
Trypan blue	e.g. Gibco	15250-061	live cell staining
Neubauer hemocytometer	e.g. Prosource Scientific	3500	alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems
50 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	14-432-23
15 ml Falcon tubes	e.g. Fisherbrand	05-527-90
20 ml syringe	e.g. BD Medical	14-820-19
10 ml serological pipette	e.g. Falcon	357551
30 mm cell culture dish	e.g. Nunc	153066	for standard culture of cardiomyocytes
30 mm cell culture dish, glass bottom	MatTek	P35G-0-10-C	for live cell imaging with inverted microscope
10 cm cell culture dish	e.g. Nunc	172958	for preplating
Escort III	Sigma	L3037	for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000
Lipofectamine 2000	Life Technologies, Invitrogen	52887	substitute for Escort III
			Buffers and media: Isolation medium (filter sterilize) 20 mM BDM 0.0125% trypsin in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+) Digestion medium (filter sterilize) 20 mM BDM 1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix in L15 medium Plating medium 65% DMEM high glucose 19% M-199 10% horse serum 5% fetal calf serum 1% penicillin/streptomycin Maintenance medium 78% DMEM high glucose 17% M-199 4% horse serum 1% penicillin/streptomycin optional: 1 μM AraC 1 μM isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine The plating and maintenance medium can be stored at 4 °C for up to 6 months.