Resultaterne og konklusionerne i denne rapport, er dem af forfatterne og ikke nødvendigvis repræsentere Centers for Disease Control og Forebyggelse.
De apikale og basolaterale overflader af luftvejs-epitelceller viser retningsbestemte reaktioner på patogen eksponering in vivo. Således ideel in vitro-modeller til at undersøge cellulære reaktioner til luftvejspatogener polariserer og danner apikale og basolaterale overflader. Én sådan model er differentieret normale humane bronchiale epithelceller (NHBE). Dette system kræver lunge vævsprøver, ekspertise isolering og dyrkning af epitelceller fra væv, og tiden til at frembringe en luft-væske-grænsefladen kultur.
Calu-3 celler, afledt fra en human bronkial adenocarcinom, er en alternativ model til undersøgelse af respons på proximale luftvejs-epitelceller i luftvejene insult 1, farmakologiske forbindelser 2-6, og bakteriel 7-9 og virale patogener, herunder influenzavirus, rhinovirus og svær akut respiratorisk syndrom – associeret coronavirus 10-14. For nylig, we viste, at Calu-3 celler er modtagelige for respiratorisk syncytialvirus (RSV)-infektion i overensstemmelse med NHBE 15,16. Her har vi detalje oprettelsen af et polariseret, væske-dækket kultur (LCC) af Calu-3-celler, der fokuserer på de tekniske detaljer vedrørende dyrkning og dyrkning af Calu-3-celler, opretholde celler, der er blevet dyrket i LCC, og vi præsenterer den fremgangsmåde til udførelse af respiratorisk virusinfektion af polariserede Calu-3 celler.
Konsekvent at opnå polariseret Calu-3 LCC, Calu-3 celler skal nøje subdyrkes før dyrkning i Transwell skær. Calu-3 monolagskulturer bør forblive under 90% konfluens, bør videredyrkes færre end 10 gange fra frossen lager, og bør regelmæssigt forsynes med frisk medium. Når dyrket i Transwells skal Calu-3 LCC skal håndteres med forsigtighed. Uregelmæssige medieændringer og mekanisk eller fysisk afbrydelse af cellelag eller plader negativ indflydelse polarisering forflere timer eller dage. Polarization overvåges ved at vurdere trans-epitel elektrisk modstand (TEER) og verificeres ved at evaluere den passive ækvilibrering af natrium fluorescein mellem de apikale og basolaterale rum 17,18. Når TEER plateauer på eller over 1.000 Ω × cm 2, Calu-3 LCC er klar til at bruge til at undersøge cellulære reaktioner på respiratoriske patogener.
Ved etableringen af Calu-3 LCC i Transwell inserts kan celler ikke polarisere overhovedet, eller måske ikke fuldt polarisere som defineret i et TEER ≥ 1000 Ω x cm 2 og ≤ 1% natrium fluoresceinfarvestoffet ækvilibrering mellem de apikale og basolaterale rum. Desuden kan Calu-3 celler i LCC fuldt polariserer, men TEER ikke stemmer overens mellem målingerne. Selv om udsving i TEER målinger af Calu-3 LCC er normale fra dag til dag, er når det er fuldt polariseret, dramatiske udsving i TEER forventes først at kulturen naturligt falder med alderen, hvilket kan være så lidt som 5 uger eller så længe 12 uger efter podning.
Evnen af Calu-3 LCC at polarisere afhænger til dels af, hvordan cellerne vedligeholdes og subkultiveres før anvendelse i Transwell system. Celler, der er vokset ud over 90% konfluens som et monolag ved subkultivering, der er blevet subkultiveret mere end 10 gange fra frossen lager, eller som ikke eren forsynet med frisk medium med jævne mellemrum er mindre tilbøjelige til fuldt ud at polarisere, og enhver polarisering sandsynligvis vil falde hurtigt. Ufuldstændige eller fuldstændige mangel på polarisation kan også tilskrives forskelle i materiale og porestørrelse Transwells anvendes til Calu-3 LCC, og parti-til-parti variation i Transwells med lignende sammensætning, og porestørrelsen kan også påvirke polarisering. Større porestørrelser kan tillade Calu-3 at vokse gennem Transwell membran ind i basolaterale rum, forhindrer kulturen fra polariserende. Et fravær af polarisering kan også skyldes bakterievækst, angives med overskygges dyrkningsmedium, hvilket fører til efterfølgende fordeling af de tætte forbindelser mellem Calu-3 celler.
Variable TEER målinger af Calu-3 LCC kan skyldes mekaniske forstyrrelser af Calu-3 LCC cellemonolag, indsatsene eller pladerne selv. Medium ændringer og TEER målinger bør udføres uden pipettespidser eller elektrode fører røre cellerne. Under udførelsen af disse operationer, bør der udvises omhu for at undgå at indføre luftbobler i de apikale og basolaterale rum, som vil forstyrre evne til voltohmmeter at detektere modstand. Evnen af voltohmmeter at detektere modstand i en kultur, der er faktisk polariseret kan også begrænset af proteinbelægninger på elektroderne. Denne ophobning kan fjernes ved forsigtig slibning, eller kan korrigeres ved udskiftning af elektroden.
Når Calu-3 LCC fuldstændig polarisering og TEER ikke mere er stigende, Calu-3 LCC er klar til anvendelse som en in vitro model til karakterisering host lungeepitelceller celle respons på luftvejsinfektion. Dette system muliggør bedre karakterisering af retningsbestemte reaktioner på patogener i forhold til monolag-dyrkede lunge cellelinier traditionelt anvendes til at studere respiratoriske patogener, såsom A549 og HEp-2-celler, med de yderligere fordele, Calu-3 LCC being hurtigere at udvikle, lettere opnås, og mindre dyrt at generere end primære, polariserede, differentieret NHBE. Svarende til NHBE, polariseret Calu-3 viser tight junction-dannelse og fremstilling af muciner. Men i modsætning NHBE, har polariserede Calu-3 celler ikke differentiere til lag af basale celler og cilierede søjleformede epitelceller, og få polariserede Calu-3 celler udvikler cilia-fremspring 19. Således kan være nyttig i behandlingen af polariserede reaktioner luftvejene epitelceller til respiratorisk fornærmelse, er polariseret Calu-3 LCC ikke en ideel model til at undersøge luftvejene udvikling eller remodeling som reaktion på respiratorisk fornærmelse eller skade. Slimproduktion fra dyrkede celler in vitro kan påvirke cellulær infektivitet, og frigivelse af infektiøst virus og virus spredes i en polariseret model, og en direkte sammenligning af slimproduktion mellem polariseret Calu-3 LCC og polariseret, differentieret NHBE er ikke rapporteret . A549 og HEp-2-celler enre lettere at kulturen end Calu-3 celler, dog i modsætning Calu-3 LCC, danner de ikke polariserede kulturer ved dyrkning på Transwell inserts, og er således ikke ideelle modeller til undersøgelse in vitro svarene fra polariserede epithelceller til respiratorisk virusinfektion .
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Elisabeth Blanchard for hendes teknisk bistand. Resultaterne og konklusionerne i denne rapport, er dem af forfatterne og ikke nødvendigvis repræsentere Centers for Disease Control og Forebyggelse.
REAGENTS | |||
Calu-3 | ATCC | HTB-55 | |
0.05% Trypsin – 0.02% EDTA | Gibco/Invitrogen | 25300 | |
Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Gibco/Invitrogen | 07-00100DK | |
Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30070.03 | Heat-inactivate, 56 °C, 30 mins |
Non-essential amino acids 100X (10 mM) | Gibco/Invitrogen | 11140 | Store at 4 °C in the dark |
L-glutamine | Gibco/Invitrogen | 25030 | |
HEPES | Gibco/Invitrogen | 15630 | |
EMEM-10% FBS (EMEM-10%) | Supplement EMEM with heat-inactivated FBS to 10% serum, sterile-filter | ||
EMEM-20% FBS + supplements (EMEM-20%+S) | Supplement EMEM to final concentrations: heat-inactivated FBS, 20%; 1X amino acids; 2 mM L-glutamine; 10 mM HEPES; sterile-filter | ||
24-well Transwell plates | Corning Costar | 3472 | 3 μm pore size, polyester |
Trypan blue | Gibco/Invitrogen | 15250 | |
Ethanol | Sigma | E7023 | Prepare to 70% using sterile dH2O |
Dulbecco’s PBS (D-PBS) | Invitrogen | 14040 | |
Non-fluorescent buffer | 118 mM NaCl; 4.75 mM KCl; 2.53 mM CaCl2×H2O; 2.44 mM MgSO4; 1.19 mM KH2PO4; 25 mM NaHCO3 in sterile water; sterile-filter | ||
Sodium fluorescein | Sigma | 6377 | 1 mg/ml in sterile non-fluorescent buffer; sterile-filter, protect from light; store at 4 °C up to 6 months |
EQUIPMENT | |||
Voltohmmeter | World Precision Instruments | ||
STX2 electrode | World Precision Instruments | ||
ELISA plate reader | Capable of measuring A486 or A490 |