RNA<em> In situ</em> Hybridisering i hela Mount Embryon och Cell Histologi Anpassad för marina Elasmobranchii
Summary
Genom att kombinera metoder för RNA hela montering<em> In situ</em> Hybridisering och histologi, kan genuttryck kopplas med beslut cell öde i det utvecklande embryot. Dessa metoder har anpassats till marina Elasmobranchii och underlätta användningen av dessa djur som modellorganismer för biomedicinsk, toxikologi och jämförande studier.
Abstract
Marina Elasmobranchii värderas djurmodeller för biomedicinska och genomiska studier eftersom de är de mest primitiva ryggradsdjuren att ha adaptiv immunitet och har unika mekanismer för osmoregulation 1-3. Eftersom de mest primitiva levande käkförsedda-ryggradsdjur med parade bihang, Elasmobranchii är en evolutionärt viktig modell, särskilt för studier i evolution och utveckling. Marina Elasmobranchii har också använts för att studera Aquatic Toxicology och stress fysiologi i relation till klimatförändringarna 4. Således är utveckling och anpassning av metoder för att underlätta och öka användningen av dessa primitiva ryggradsdjur till flera biologiska discipliner. Här presenterar jag den framgångsrika anpassningen av RNA hela montera in situ hybridisering och histologiska tekniker för att studera genuttryck och cell histologi i Elasmobranchii.
Övervakning genuttryck är ett kännetecken verktyg för utvecklings Biologists, och är allmänt används för att undersöka utvecklingsprocesser 5. RNA hela montera in situ hybridisering möjliggör visualisering och lokalisering av specifika gentranskript i vävnader i embryot. Uttrycksmönstret av en gen budskap kan ge insikt i vad utvecklingsprocesser och cell beslut öde en gen kan styra. Genom att jämföra uttrycksmönstret av en gen i olika utvecklingsstadier, kan insikt vinnas i hur rollen av en gen ändras under utveckling.
Medan hela montera in situ är ett medel för att lokalisera genuttryck till vävnad, histologiska tekniker tillåter för identifiering av differentierade celltyper och vävnader. Histologiska fläckar har olika funktioner. Allmänna fläckar används för att markera cellmorfologi, t.ex. hematoxylin och eosin för allmän färgning av kärnor och cytoplasma, resp. Andra fläckar kan lyfta specifik celltyper. Till exempel färga Alcian blå redovisas i denna uppsats är en allmänt använd katjonisk färg för att identifiera mucosaccharides. Färgning av mag-tarmkanalen med Alcian blue kan identifiera fördelningen av bägarceller som producerar mucosaccharides. Variationer i mucosaccharide beståndsdelar på korta peptider skiljer gobletceller per funktion i mag-tarmkanalen 6. Genom att använda RNA hela mount in situ 's och histokemiska metoder samtidigt kan cellöde beslut kopplas till gen-uttryck.
Även RNA in situ 's och histokemi används flitigt av forskare, har sin anpassning och användning i marina Elasmobranchii träffade begränsad och varierande framgång. Här presenterar jag protokoll som utvecklats för Elasmobranchii och används regelbundet i mitt laboratorium. Även om ytterligare modifiering av RNA in situ s hybridiseringsmetod kan behövas för att anpassa sig till olika arter beskrivna protokollen här provide en bra utgångspunkt för forskare som vill anpassa användningen av marina Elasmobranchii till sina vetenskapliga undersökningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
De presenterade protokoll är klassiska metoder för att övervaka genuttryck och identifiera differentierade celltyper och har anpassats för användning i marina Elasmobranchii. Ytterligare modifieringar av dessa protokoll kan behövas för att anpassa sig till olika Elasmobranchii arter.
Den vanligaste oro RNA hela montera in situ 's är risken för RNas kontaminering och därmed nedbrytningen av RNA-sonden och endogena meddelanden. Två aspekter måste beaktas: syntesen av r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jag vill tacka de många studenter som har arbetat i mitt laboratorium och bidragit till utvecklingen av dessa protokoll. NAT har fått stöd från Skidmore-Union Network, ett projekt upprättas med en NSF utbetalda förskottet bidrag.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 10 x transcription buffer | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA labeling mix | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitor | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polymerase – SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAse-free | Roche | 10-776-785-001 | |
| Yeast RNA | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Netwell inserts | Electron Microscopy Sciences | 64713-00 | Netwells for use in 6-well tissue culture dishes |
| 6-well tissue culture plate | Corning | 3516 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamide | Fisher | BP227500 | |
| Proteinase K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | EMD | HX0635-1 | |
| Sheep serum | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Fragments | Roche | 1137-6623 | |
| Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ‘s. | |||
| 1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5 | Electron Microscopy Sciences | 26323-01 | |
| Nuclear Fast Red | Electron Microscopy Sciences | 26078-05 | |
| DPX Mountant | Electron Microscopy Sciences | 13510 | |
| Paraffin (Paraplast X-tra) | McCormick Scientific | 39503002 | |
| 10% Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Glass scintillation vials with screw-cap lids | Weaton Science Products | 986540 | |
| Stainless steal base molds | Tissue-Tek | 4161-4165 | Multiple sizes available. |
| Cassettes | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slide warmer | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Tissue Embedder | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Microtome, rotary | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slide Staining Set | Electron Microscopy Sciences | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Holder | Electron Microscopy Sciences | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slides | Fisherbrand | 12-550-17 | |
| Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain. |
References
- Forester, R., Goldstein, L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs. Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).
- Shuttleworth, T., Shuttleworth, R. . Physiology of elasmobranch fishes. , 171-194 (1988).
- Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science. 217, 1214-1222 (1982).
- Ballatori, N., Villalobos, A. Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models. Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).
- Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).
- Jass, J. R., Walsh, M. D. Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review. J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).
- Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae). J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).
- Echelard, Y., et al. Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Cell. 75, 1417-1430 (1993).
- Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
- Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Ch. 7. Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, 7.82 (2001).
- Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).
- Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. . Theory and practice of histotechnology. , (1980).
- Theodosiou, N. A., Simeone, A. Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea. Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).
- Filipe, M. I. Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review. Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).
- Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria. Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).
- Reid, B. J., et al. Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett’s esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort. Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).
- Mowry, R. Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status. Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).
- Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut. Development. 125, 2791-2801 (1998).
