عزل والخلايا اللمفاوية المناعية والخلايا الجذعية من الفئران باير لالرقع
Summary
هناك اهتمام متزايد في فهم وظائف مناعية المجموعات السكانية الفرعية معينة من الخلايا في بقع باير (PPS)، والمواقع الأساسية استقرائي من الأنسجة اللمفاوية الأمعاء المرتبطة. نحن هنا الخطوط العريضة لإعداد بروتوكولات موازية PP الاستعدادات خلية واحدة لتحليل تدفق cytometric وcryosections PP لالمناعية.
Abstract
بقع باير (PPS) جزءا لا يتجزأ من أنسجة الأمعاء المرتبطة اللمفاوية (GALT) ولعب دورا محوريا في الأمعاء والترصد المناعي التوازن. يتم أخذ عينات باستمرار مستضدات الجسيمات والجراثيم في لمعة الأمعاء من قبل خلايا M PP في ظهارة جريب المرتبطة (FAE) ونقلها إلى شبكة الكامنة وراء الخلايا الجذعية (DCS)، الضامة، والخلايا الليمفاوية. في هذه المقالة، ونحن تصف بروتوكولات التي هي ذكر المكتب الصحفى الفئران (ط) فصل في تعليق خلية واحدة وتعرض لالتدفق الخلوي و (الثاني) والتي أعدت للcryosectioning المناعية. لالتدفق الخلوي، ذكر المكتب الصحفى لفصل ميكانيكيا ثم يصفى من خلال 70 ميكرومتر الأغشية لتوليد تعليق خلية واحدة خالية من الخلايا الظهارية والحطام الكبيرة. بدءا من 20-25 ذكر المكتب الصحفى (من أربعة الفئران)، وهذه الطريقة سريعة وقابلة للتكرار غلة يبلغ عدد سكانها> 2.5 × 10 6 خلايا مع> بقاء الخلية 90٪. لجديدة، cryosectioningذكر المكتب الصحفى لاي مغمورة معزولة في قطع الأمثل المتوسطة (OCT) درجة الحرارة، الأداة الإضافية المجمدة في النيتروجين السائل، ثم مقطوع باستخدام cryomicrotome. أقسام الأنسجة (5-12 ميكرون) هي الهواء المجفف، ثابتة مع الأسيتون أو الميثانول، وثم تعرض لimmunolabeling.
Introduction
بقع باير (PPS) هي المجاميع العيانية من بصيلات اللمفاوية المنظمة الحالية في جميع أنحاء الأمعاء الدقيقة للإنسان والفئران (الشكل 1) وتشكل المواقع الأساسية التي تم تهيئتها الاستجابات المناعية المخاطية ضد مستضدات الغذائية والبكتيريا المتعايشة، ومسببات الأمراض الميكروبية، واللقاحات عن طريق الفم 1-4. على عكس الأنسجة الأخرى اللمفاوية الطرفية مثل العقد الليمفاوية المساريقي، ذكر المكتب الصحفى تفتقر الأوعية اللمفاوية وارد. كما هي مدفوعة، مثل الاستجابات المناعية التكيفية في ذكر المكتب الصحفى ردا على مستضدات المستمدة من تجويف الأمعاء. ويتم إنجاز أخذ عينات من المستضدات لمعي من قبل ظهارة جريب المرتبطة (FAE)، الذي يتكون من كل من الخلايا المعوية ومستضد أخذ العينات المعروفة باسم الخلايا M. تحت FAE، في قبة شبه الظهارية (SED) المنطقة، وتقع شبكة من الخلايا الجذعية (DCS) تتداخل مع الضامة، والخلايا B، وCD4 + T الخلايا 5-9. في صميم كل follicl اللمفاوية PPه هي الخلايا الجذعية الجريبي (FDCS) وخلية الغنية المركزية B مركز جرثومي، ويحيط بها مناطق T بين الجريبات الخلية الغنية. أخذ العينات بواسطة المستضد النتائج ذكر المكتب الصحفى في تطوير خلية + B ايغا plasmablasts وCD4 + الخلايا المستجيب والذاكرة التي الصفيحة المخصوصة البذور المحيطة ومنح الحصانة لمجموعة واسعة من الغزاة المخاطية.
تشريح الأحداث المناعية المعقدة المرتبطة مستضد أخذ العينات، وتجهيز، وعرض في ذكر المكتب الصحفى هو مهمة شاقة، بالنظر إلى أن خلايا PP لا تشكل سوى نسبة ضئيلة من الخلايا اللمفاوية في مجموع مخاطية الأمعاء. للمساعدة في توصيف في المختبر من خلايا في هذه البيئة، ونحن نقدم لإعداد بروتوكول مجموع الماوس خلايا PP لتحليل تدفق cytometric والوظيفية، وكذلك بروتوكول لإعداد PP cryosections المناعي للفحص المجهري وimmunohistology. لدينا بروتوكول لعزل وتوصيف، والمناعية من مذكرات التفاهمه خلايا PP ليست رواية في حد ذاتها، كما يتضح من حقيقة أن هناك إشارات عديدة يعود تاريخها إلى أكثر من 25 عاما أن أذكر هذه التقنيات 5،6،9-11. بدلا من ذلك، لدينا بروتوكول يوفر مبسطة (والبصرية) للمحققين طريقة جمع ذكر المكتب الصحفى للمرة الأولى. ويتقن تقنيات بسهولة وصفنا وتسفر بسهولة أعداد كبيرة من الخلايا مع> بقاء الخلية 90٪. بروتوكول cryosectioning ينتج المسلسل أقسام استنساخه للغاية مثاليا للتلوين المناعي والتصوير مبائر. وعلاوة على ذلك، لدينا بروتوكول يكمل الأخريين إن الرب المقالات الأخيرة. الأولى، من قبل فوكودا والزملاء، يصف استخدام المقايسات ligated حلقة اللفائفية لتقييم امتصاص البكتيريا المسببة للأمراض من قبل خلايا M PP 12. الآخر، من خلال Geem والزملاء، ويصف العزلة وتوصيف البلدان النامية والضامة من الغشاء المخاطي المعوي الماوس، لكنه يستثني صراحة من ذكر المكتب الصحفى تحليل ال 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، قدمنا البروتوكولات موازية لإعداد التحضيرات PP خلية واحدة لتحليل تدفق cytometric والوظيفية وcryosections للالمناعية. كلتا الطريقتين هي استنساخه للغاية ويمكن الوصول إليها بسهولة، وفرت قياس التدفق الخلوي وناظم البرد المتاحة. وينبغي للمحققين مرة الأولى تجدر ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر رينجي الأغاني (ادسورث قياس التدفق الخلوي مركز كور) للمساعدة في تحليل الخلايا وهيلين جونسون (ادسورث مركز التشريح المرضي الأساسية الحيوان) لإعداد أقسام البارافين. نشكر الدكتور ريتشارد كول (ادسورث المجهر الضوئي مركز كور) للحصول على المساعدة مع المجهري متحد البؤر وجمع الصور. نود أن نعترف اندي بنتلي (ادسورث مركز الصور وتوضيحات) للحصول على المساعدة مع الرسوم المتحركة.
ويدعم MDJ من قبل مؤسسة الحياة بحوث العلوم، معهد هوارد هيوز الطبي (HHMI) زمالة. ويدعم SA من زمالة مركز البحوث وادز ورث، وشركة صحة ما بعد الدكتوراه جماعية. وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح HD061916 وGM082978.
Materials
| Item | Company | Cat. # | Comments (optional) |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| 7x7x5 mm Base Molds | Fisherbrand | 22-363-552 | |
| ImmEdge Pen | Vector Labs | H-4000 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951 | |
| Edge Rite Blade | Thermo Scientific | 4280L | |
| Anti-Mouse CD11c-PE | eBioscience | 17-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD45R/B220-APC | BD Pharmigen | 553092 | |
| Anti-Mouse CD3-FITC | BD Pharmigen | 561798 | |
| Anti-Mouse CD4-PE | BD Pharmigen | 553652 | |
| Anti- Mouse CD8-PE | BD Pharmigen | 553032 | |
| Anti-Mouse CD19-PercP | BioLegend | 115531 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red | Fisher Scientific | 14175-079 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Spleen Dissociation Medium | Stem Cell Technologies | 7915 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Fc Block | ATCC 2.4.G2 | HB-197 | Supes obtained from cell line 2.4.G2 |
| Curved Scissor | F.S.T | 14061-09 | |
| Cryostat | Leica | 3050S | |
| FACS Calibur | BD | ||
| Countess Cell Counter | Invitrogen | ||
| Hematoxylin | Richard Allan | 7211 | |
| Eosin | Richard Allan | 71304 | |
| Formalin | Starplex Scientific | 3661 | |
Table 1. Reagents and equipment used in this study. |
References
- Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA’s complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
- Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
- Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
- Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
- Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer’s patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
- Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
- Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer’s Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
- Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer’s patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
- Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
- Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer’s patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).
- Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer’s patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).
