Isoleren En Immunokleuring Lymfocyten en dendritische cellen uit Patches Murine Peyer
Summary
Er is een toenemende belangstelling voor het begrijpen van de immunologische functies van specifieke subpopulaties van cellen in platen van Peyer (PP), de primaire inductieve plaatsen van darm-geassocieerd lymfeweefsel. Hier schetsen we parallel protocollen voor de voorbereiding van PP enkele cel voorbereidingen voor flowcytometrische analyse en PP cryocoupes voor immunokleuring.
Abstract
Plaques van Peyer (PP) zijn integrale componenten van het darm-geassocieerd lymfeweefsel (GALT) en spelen een centrale rol in de darm immunosurveillance en homeostase. Particulate antigenen en microben in het darmlumen worden continu bemonsterd door PP M cellen in de follikel-geassocieerde epitheel (FAE) en naar een onderliggende netwerk van dendritische cellen (DCs), macrofagen en lymfocyten. In dit artikel beschrijven we protocollen die zijn murine PP (i) gedissocieerd in enkele celsuspensies en onderworpen aan flowcytometrie en (ii) bereid voor cryosectioning en immunokleuring. Voor flowcytometrie, PPs mechanisch gedissocieerd en daarna gefiltreerd door membranen 70 urn tot enkele celsuspensies zonder epitheelcellen en grof vuil genereren. Beginnen met 20-25 PP (van vier muizen), deze snelle en reproduceerbare methode levert een populatie van> 2,5 x 10 6 cellen met> 90% levensvatbaarheid van de cellen. Voor cryosectioning, versely geïsoleerde PP worden ondergedompeld in Optimale Cutting Temperatuur (LGO) medium, snap-ingevroren in vloeibare stikstof, en dan coupes met behulp van een cryomicrotoom. Weefselcoupes (5-12 um) de lucht gedroogd, gefixeerd met aceton of methanol, en vervolgens onderworpen aan immunokleuring.
Introduction
Peyer's Patches (PP) zijn macroscopische aggregaten georganiseerde lymfoïde follikels aanwezig in de dunne darm van mensen en muizen (figuur 1) en het primaire plaatsen waar mucosale immuunresponsen ingeleid dieet antigenen, commensale bacteriën, pathogene micro-organismen en orale vaccins 1-4. In tegenstelling tot andere perifere lymfoïde weefsels zoals de mesenteriale lymfeklieren, PPs missen afferente lymfevaten. Als zodanig adaptieve immuunreacties in PP worden aangedreven in reactie op antigenen uit het darmkanaal. De bemonstering van luminale antigenen wordt uitgevoerd door het de follikel-geassocieerde epitheel (FAE), die bestaat uit zowel enterocyten en antigen-sampling cellen bekend als M cellen. Onder de FAE, in de sub-epitheliale dome (SED) gebied, ligt een netwerk van dendritische cellen (DCs) vermengd met macrofagen, B-cellen en CD4 + T-cellen 5-9. Aan de basis van elk PP lymfoïde follicle zijn folliculaire dendritische cellen (FDC) en een B cel-rijk centrale kiemcentrum, geflankeerd door T cellenrijke interfolliculaire zones. Antigen bemonstering door PP resulteert in de ontwikkeling van IgA + B cel plasmablasten en CD4 + effector en geheugencellen dat zaad de omringende lamina propria en bieden weerstand tegen een breed scala aan mucosale indringers.
Opheldering van de complexe immunologische afspraken verbonden aan antigeen sampling, verwerking en presentatie in PP's is een moeilijke taak, gezien het feit dat PP cellen slechts een fractie van de totale lymfoïde cellen in het darmslijmvlies vormen. Om in de steun in vitro karakterisatie van cellen in deze omgeving, bieden wij een protocol voor het bereiden van het totaal muis PP cellen voor flowcytometrische en functionele analyse, evenals een protocol voor de bereiding PP cryocoupes voor immunofluorescentie microscopie en immunohistologie. Ons protocol voor de isolatie, karakterisering, en immunokleuring van mouse PP cellen is niet nieuw op zich, zoals blijkt uit het feit dat er tal van verwijzingen dateren van meer dan 25 jaar dat noemen deze technieken 5,6,9-11. Integendeel, ons protocol biedt een gestroomlijnde (en visuele) methode voor onderzoekers verzamelen PPs voor de eerste keer. De technieken beschrijven we gemakkelijk beheerst en gemakkelijk grote aantallen cellen leveren met> 90% levensvatbaarheid van de cellen. De cryosectioning protocol levert zeer reproduceerbare seriecoupes ideaal voor immunofluorescentiekleuring en confocale beeldvorming. Verder is onze protocol vormt een aanvulling op twee andere recente Jove artikelen. De eerste door Fukuda en collega's beschrijven het gebruik van geligeerde ileal loop assays om de verspreiding van pathogene bacteriën te beoordelen door PP M cellen 12. De andere, door Geem en collega's, beschrijft de isolatie en karakterisering van DCs en macrofagen van de muis darmslijmvlies, maar uitdrukkelijk uitgesloten PP's uit hun analyse 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel, hebben we parallel protocollen voor de voorbereiding van PP enkele cel voorbereidingen voor flowcytometrische en functionele analyse en vriescoupes voor immunokleuring. Beide methoden zijn zeer reproduceerbaar en gemakkelijk toegankelijke, ontvangen een flowcytometer en cryostaat zijn. Voor de eerste keer onderzoekers moet worden opgemerkt dat in vergelijking met de milt, totale cel opbrengsten van PP's zijn relatief gering. Niettemin, het protocol schetsen we het algemeen rendementen tussen 0,8-1,2 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Renjie Song (Wadsworth Center Flowcytometrie Core) voor hulp bij het cel-analyse en Helen Johnson (Wadsworth Center Animal histopathologie Core) voor de bereiding van paraffine secties. Wij danken dr. Richard A. Cole (Wadsworth Center Licht Microscopy Core) voor hulp bij confocale microscopie en fotocollectie. We willen graag Andy Bentley (Wadsworth Foto en Illustratie) erkennen voor hulp met animaties.
MDJ wordt ondersteund door de Life Sciences Research Foundation, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Fellowship. SA wordt ondersteund door een Wadsworth Center-Health Research Inc intramurale postdoctoraal fellowship. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH subsidie HD061916 en GM082978.
Materials
| Item | Company | Cat. # | Comments (optional) |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| 7x7x5 mm Base Molds | Fisherbrand | 22-363-552 | |
| ImmEdge Pen | Vector Labs | H-4000 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951 | |
| Edge Rite Blade | Thermo Scientific | 4280L | |
| Anti-Mouse CD11c-PE | eBioscience | 17-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD45R/B220-APC | BD Pharmigen | 553092 | |
| Anti-Mouse CD3-FITC | BD Pharmigen | 561798 | |
| Anti-Mouse CD4-PE | BD Pharmigen | 553652 | |
| Anti- Mouse CD8-PE | BD Pharmigen | 553032 | |
| Anti-Mouse CD19-PercP | BioLegend | 115531 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red | Fisher Scientific | 14175-079 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Spleen Dissociation Medium | Stem Cell Technologies | 7915 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Fc Block | ATCC 2.4.G2 | HB-197 | Supes obtained from cell line 2.4.G2 |
| Curved Scissor | F.S.T | 14061-09 | |
| Cryostat | Leica | 3050S | |
| FACS Calibur | BD | ||
| Countess Cell Counter | Invitrogen | ||
| Hematoxylin | Richard Allan | 7211 | |
| Eosin | Richard Allan | 71304 | |
| Formalin | Starplex Scientific | 3661 | |
Table 1. Reagents and equipment used in this study. |
References
- Mantis, N. J., Rol, N., Corthesy, B. Secretory IgA’s complex roles in immunity and mucosal homeostasis in the gut. Mucosal. Immunol. 4, 603-611 (2011).
- Neutra, M., Mantis, N., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissue. Nature Immunology. 2, 1004-1009 (2001).
- Rescigno, M., Sabatino, A. D. i. Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J. Clin. Invest. 119, 2441-2450 (2009).
- Suzuki, K., Kawamoto, S., Maruya, M., Fagarasan, S. GALT: organization and dynamics leading to IgA synthesis. Adv. Immunol. 107, 153-185 (2010).
- Iwasaki, A., Kelsall, B. L. Localization of distinct Peyer’s patch dendritic cell subsets and their recruitment by chemokines macrophage inflammatory protein (MIP)-3alpha, MIP-3beta, and secondary lymphoid organ chemokine. Journal of Experimental Medicine. 191, 1381-1394 (2000).
- Iwasaki, A. Mucosal dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 25, 381-418 (2007).
- Lelouard, H., Fallet, M., de Bovis, B., Meresse, S., Gorvel, J. P. Peyer’s Patch Dendritic Cells Sample Antigens by Extending Dendrites Through M Cell-Specific Transcellular Pores. Gastroenterology. 42, 592-601 (2011).
- Lelouard, H., et al. Pathogenic bacteria and dead cells are internalized by a unique subset of Peyer’s patch dendritic cells that express lysozyme. Gastroenterology. 138, 173-184 (2010).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infect. Immun. 71, 504-509 (2003).
- Favre, L., Spertini, F., Corthesy, B. Secretory IgA possesses intrinsic modulatory properties stimulating mucosal and systemic immune responses. J. Immunol. 175, 2793-2800 (2005).
- Kelsall, B. L., Strober, W. Distinct populations of dendritic cells are present in the subepithelial dome and T cell regions of the murine Peyer’s patch. J. Exp. Med. 183, 237-247 (1996).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225 (2011).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine. J. Vis. Exp. (63), e4040 (2012).
- Lopez-Guerrero, D. V., et al. Rotavirus infection activates dendritic cells from Peyer’s patches in adult mice. J. Virol. 84, 1856-1866 (2010).
