Lentiviruses הזרקת Stereotactic של microRNA-לבטא באזור CA1 היפוקמפוס העכבר והערכה של תוצאות ההתנהגות
Summary
יש מיקרו RNA תפקידים משמעותיים במבנה המוח ותפקודו. כאן אנו מתארים שיטה לאכיפת מירנה היפוקמפוס יתר ביטוי באמצעות הזרקת stereotactic של lentivirus מירנה מביע מהונדס. גישה זו יכולה לשמש כדרך מהירה יחסית על מנת להעריך את<em> In vivo</em> השפעות של miRNAs ביטוי יתר של אזורים ספציפיים במוח.
Abstract
מיקרו RNA (miRNAs) הם מולקולות רגולטוריות קטנות חד גדילי RNA כ -22 נוקלאוטידים ארוכים שעשוי כל יעד תעתיקי mRNA רבים ומסלול כולו עמום ביטוי גנים על ידי הרס ו / או תרגום עיכוב של יעדים אלה ישכנעו. כמה miRNAs לשחק תפקיד מפתח בשמירה על מבנה ותפקוד עצביים ובתפקודי מוח ברמה גבוהה יותר, והם חיפשו שיטות לרמותיהם מניפולציה בשביל לחקור את הפונקציות האלה. כאן, אנו מציגים שיטה ישירה בvivo לבחינת ההשלכות הקוגניטיביות של miRNAs נאכפה עודפת בעכברים על ידי הזרקה של חלקיקי נגיף stereotactic מירנה קידוד. באופן ספציפי, בפרוטוקול הנוכחי כרוך בהזרקה לאזור CA1 בהיפוקמפוס, התורמת לגיבוש יונקים זיכרון, למידה, ותגובות לחץ, ומציע הזריקה נוחה. את הקואורדינטות נמדדות לפי גבחת העכבר וזלוף הווירוס נמצא בשליטה דיגיטלית ושמר איטיים מאוד.לאחר הזרקה, פצע הניתוח הוא חתום ואת בעלי החיים להתאושש. Lentiviruses קידוד משתיקי קול של מטרות mRNA המתאימות לשמש כדי לסבך את מירנה / יעד האינטראקציה הספציפית אחראית לאפקט הנצפה, עם עכברים נאיביים, עכברים שהוזרקו עם מי מלח ועכברים שהוזרקו עם וקטורי lentivirus "ריקים" כקבוצת ביקורת. חודש אחד לאחר ההזרקה, החיות נבחנות במבוך המים של מוריס (MWM) להערכת למידת הניווט שלהם ויכולות זיכרון. MWM הוא המכל עגול מלאים במים צבעוניים עם פלטפורמה קטנה שקועה 1 ס"מ מתחת לפני המים. רמזים חזותיים יציבים סביב הטנק לאפשר ניווט המרחבי (קול והשדה המגנטי של כדור הארץ עשוי גם לסייע לבעלי החיים בניווט). ניטור מצלמת וידאו מאפשר מדידת מסלול השחייה ואת הזמן כדי למצוא ויסתכם בפלטפורמה. העכבר ראשון שלמד את ההרכבה הפלטפורמה הנסתרת מציעה מפלט מהחייה הכפויה, אלא לאחר מכן הוא נבדק על שימוש בבריחה וF זהinally, הפלטפורמה מוסרת ובדיקות בדיקה לבחון אם העכבר זוכר את מיקומו הקודם. בדיקות חוזרות ונשנות על פני כמה ימים רצופים להדגיש ביצועים משופרים של עכברים נבדקו בlatencies קצר יותר כדי למצוא ולהתקין את הפלטפורמה, ומסלולים כיותר ישירים כדי להגיע לפלטפורמה או מיקומו. כישלון להראות שיפור כזה מייצג לקוי למידה וזיכרון ו / או חרדה, אשר לאחר מכן ניתן לבחון באופן ספציפי (לדוגמה: במבוך בתוספת המוגבה). גישה זו מאפשרת אימות של miRNAs ספציפית ותמלילי היעד בהקוגניטיבית ו / או תהליכים הקשורים ללחץ למד.
Introduction
התפקיד של miRNAs מסוימת בתפקוד מערכת עצבים באחרונה לערער על ידי הזרקת lentiviral במספר מחקרים. MiRNAs כבר מצא להיות חיוני לשמירה ועיצוב מחדש מבנה סינפסה 1, 2 synaptogenesis ושיפוץ סינפסה ותחזוקה 3. מחקרים אלה ממליצים כי miRNAs עוסקות, דרך השפעות הרגולטוריות ריבוד בשניהם בעיצוב למעלה ובשמירה על התפוקה העיקרית של מערכת העצבים, תפקוד הקוגניטיבי. הזרקה של חלקיקי Stereotactic lentivirus לאזורים ספציפיים במוח המכרסם מאפשרת מחפשת שינויים במורפולוגיה סינפסה ופעילות עצבית, ושימש להקמת המשמעות התפקודית של תמלילי ביטוי יתר 4,5. זיהום ישיר של תאי עצב באזורי המוח מוגדרים היטב עם lentiviruses מירנה-להביע עשויה להיות מעורב במחקרים של הזדקנות, הפרעות במוח וניוון מוחיים, מחקרים של מירנהים בתחום של רגולציה התנהגותית 6-8 נמצא במצב הרבה פחות מתקדם, והזרקת stereotactic של מירנה-להביע חלקיקי lentivirus ואחרי בדיקות התנהגותיות עשוי להיות שימושי למטרות האמורות. שיטה הרבה יותר מייגע לגרימה מעל או מתחת, ביטוי כרוך בהנדסה גנטית עכברים בנוקאאוט דפיקה באו. מערכות גנטיות נוספות יכולות לאפשר לבקרה מותנית ובזמן על ביטוי (למשל Cre-קס, מערכות ט), אך אלה כמעט לא להציע סגוליות המרחבי של הליך ההזרקה וכמעט תמיד יש כמות מסוימת של דליפות. כמו כן, את הנהלים ההנדסיים אינם דורשים ניתוח, וניתן להשתמש בכל מעבדות עם שחזור טוב יחסית, עם זאת, שהם איטיים יותר ודורשים הרבה יותר כוח אדם ובמשאבים כספיים. בנוסף, השליטה הזמנית של מעל או מתחת הביטוי בעכברים שהוזרקו הוא הרבה יותר מדויק בהשוואה לעכברים מהונדסים גנטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הזרקת Stereotactic של lentivirus היא שיטה מהירה יחסית להערכה בvivo עבור שניהם למעלה או למטה רגולציה של גנים וmiRNAs שונים. החלופה העיקרית היא עכבר מהונדס גנטי אשר הוא טכניקה רב הרבה יותר מפרכת ושעה לאחר מכן זריקת lentivirus ישירה. בנוסף, הרגולציה למעלה, בהזרקת lentivirus, מתרחשת בזמן מסוי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מרכז אדמונד ולילי ספרא למדעי המוח (SB מלגה), התכנית המורשית ביו רפואית מדע השותפות של הקרן הלאומית למדע (מענק מס '378/11, ל"מ) וקרן גרמנית למדע מחקר ופיתוח (GIF) (גרנט 1093-32.2/2010 מס, לHS).
Materials
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment – Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 |
References
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
- Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer’s disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
- Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
- Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer’s disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).
- Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).
