Den nåværende protokollen gir en detaljert steg-for-steg beskrivelse av prosedyrene som kreves for å utføre målinger av luftveiene mekanikk samt vurdering av luftveiene respons på inhalert methacholine hos mus ved hjelp av tvungen svingning teknikk (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canada).
Tvungen svingning teknikk (FOT) er et kraftig, integrerende og translasjonsforskning verktøy som tillater den eksperimentelle vurdering av lungefunksjon hos mus i en omfattende, detaljert, presis og reproduserbar måte. Det gir målinger av luftveiene mekanikk gjennom analyse av trykk og volum signaler ervervet i reaksjon på forhåndsdefinert, liten amplitude, oscillatoriske luftstrøm bølgeformer, som vanligvis anvendes ved faget luftveier åpning. Denne protokoll detaljer trinnene som kreves for å tilstrekkelig utføre tvungen svingning målinger hos mus ved hjelp av en datastyrt stempel ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, QC, Canada). Beskrivelsen er delt inn i fire deler: forberedende skritt, mekanisk ventilasjon, lungefunksjon målinger, og dataanalyse. Det inkluderer også informasjon om hvordan du vurdere luftveiene respons på inhalert methacholine i bedøvede mus, en vanlig anvendelse av denne technique som også strekker seg til andre utfall og ulike lunge patologi. Målinger innhentet hos naive mus samt fra en oksidativ-stress drevet modell av luftveiene skade presenteres for å illustrere hvordan dette verktøyet kan bidra til en bedre karakterisering og forståelse av studert fysiologiske forandringer eller sykdom modeller samt til programmer i nye forskningsområder.
Tilstrekkelig karakterisering av de mekaniske egenskapene til lungene hos små dyr har blitt viktig siden det spirende av murine modeller i luftveiene vitenskap. Når utført ved forsert pendling teknikken (FOT), en teknikk som også brukes i mennesker, disse målingene gir en kraftig, integrerende og translasjonell tilnærming for å studere meningsfulle fysiologiske endringer. FOT målinger er vanligvis oppnås ved å analysere trykk og volum signaler ervervet i reaksjon på en forhåndsdefinert, liten amplitude, oscillatory luftstrøm bølgeform (også referert til som perturbation eller signalkilden) brukes mot motivet luftveier åpning en. I sin enkleste form vil en FOT perturbasjon være en enkelt sinusformet bølgeform ved en veldefinert frekvens. Mer komplekse perturbasjoner typisk bestå av en superposisjon av et utvalg av spesifikke (gjensidig prime) frekvens bølgeformer som dekker et bredt spektrum. Dekomponeringen av multi-frekvensinngangs-/utgangssignaler inn sine velgere ved hjelp av Fourier transform tillater beregning av luftveiene inngangsimpedans (Zrs), dvs. overføringsfunksjonen mellom input og output signaler, på hver frekvens inngår i endringen to. Derfor tillater den samtidige FOT vurdering av respiratoriske mekanikk over et område av frekvenser i et enkelt manøver 2.. Montering av avanserte matematiske modeller (f.eks Constant fase Model 3) til impedans data så tillater en oppdeling av respons i luftveiene (sentrale og perifere) og parenchymal lungevev avhengige parametere 1, 3. Fordi mange faktorer som påvirker fysiologiske respons (f.eks puste frekvens, respirasjonsvolum, lungevolum, øvre luftveier, spontane pust innsats, timing av målinger) er kontrollert og standardisert av målesystemet og eksperimentelle prosedyrer, er en teknikk capstand til å generere nøyaktige og reproduserbare målinger forutsatt at den er utført riktig. Formålet med denne artikkelen er å gi en detaljert, kronologisk beskrivelse av prosedyren som trengs for å utføre slike målinger i mus. Protokollen består av fire deler: forberedende trinn (reagenser, utstyr og fag), mekanisk ventilasjon, lungefunksjon målinger, og dataanalyse. Eksempler på representative resultatene av luftveiene mekanikk generert ved hjelp av en datastyrt stempel ventilator (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, QC, Canada) er gitt. Disse ble oppnådd fra naive mus så vel som fra et oksidativt-stress drevet modell av luftveier skade karakterisert ved luftveisinflammasjon, epitelcelle skade og luftveier med reaktivitet overfor inhalert aerosolisert metakolin 4.. Mens denne protokollen blir ofte brukt for å vurdere luftveiene respons til inhalert methacholine, strekker det i andre utfall og various patologier inkludert astma, kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), emfysem, lungefibrose, lunge-skade, samt transgene musemodeller av patologier tilsvarende human sykdom. Forskningsresultater ved hjelp av dette verktøyet kan bidra til en bedre karakterisering og forståelse av fysiologiske forandringer eller sykdom modeller samt til ekspansjon i nye forskningsområder.
Den fortsatte studiet av luftveiene dysfunksjon som gjelder astma og andre lungesykdommer er fortsatt viktig for forståelsen av underliggende mekanismer av sykdom og utvikling av behandlingstilbud. Bruken av mus til modellen luftveissykdom har vært avgjørende for å få forståelse inn i disse sykdomstilstander mekanismer. Når du vurderer å evaluere luftveier dysfunksjon i et fag så liten som en mus, ha pålitelige og nøyaktige verktøy ved å måle lungefunksjonen er kritisk. Videre har verktøy som er i stand til å gi innsikt om plasseringen av luftveiene dysfunksjon eller terapeutisk effekt er uvurderlig. Den FOT teknikken kombinerer alle disse egenskapene og gir en kraftig, integrerende og translasjonell tilnærming for å evaluere fysiologiske endringer.
For å lykkes med denne type måling i mus, må spesiell oppmerksomhet gis til noen få trinn, nemlig kalibrering av systemet, kan holdbarheten av det endotrakeale CAnnula, type forstøver (så vel som sine operative innstillinger) plassering av dyr og standardisering av lungevolum historie. I tillegg, er det absolutt nødvendig for å oppnå gyldige datasett at motivets luftveiene seg passivt under målingene. Dette kan oppnås ved administrering av en muskel lammende agent, jobber på et dypt plan av bedøvelse eller ved å hyperventilere faget å indusere apné (se tabell 1). Etterforskerne kan begynne med å mestre systemet og dets drift programvare, hvis ønskelig, med prøvelaster, mens anskaffe de nødvendige ferdigheter for målinger i mus. Det ville da være logisk å generere reproduserbare resultater i naive dyr før han flyttet til sykdom modeller eller behandlede mus. Siden en viktig del av sykdom modeller i luftveiene forskning innebærer å utsette dyr for å agenter som allergener, toksiner, forurensing, sigarettrøyk eller gasser, variabilitet i resultatene oppnådd med de measurement teknikk beskrevet i denne artikkelen kan derfor bli påvirket av eksponering prosedyren brukes. Standardisering av sentrale eksperimentelle prosesser (f.eks ved hjelp av datastyrt eksponering og målesystemer 6, 13, 14) kan potensielt ha en betydelig effekt i å redusere variabilitet.
Eksemplene som presenteres i denne artikkelen representerer et utvalg av typiske resultater fra naive og klor-eksponerte mus eksperimenter mens fremhever styrken samt begrensninger i teknikken. Som det kan ses for eksempel i figur 6, er teknikken i stand til å generere lungefunksjon reproduserbare målinger. Mens lignende baseline motstand verdier ble rapportert mellom musestammer, ble forskjeller i elastance imidlertid observert 15. Betydelige endringer er også å forvente mellom spedbarn og voksne mus 16. Som for andre in vivo fysiologisk vurdering, høy presisjon resultater, slik som those generert av FOT, kommer med en innrømmelse som den naturlige tilstanden av fagene. Dette prinsippet, som er referert til som den phenotyping usikkerhetsprinsippet 1, gjelder den foreliggende protokoll i den forstand at målingene må gjøres i bedøvede, tracheotomised (eller oralt intubert) og mekanisk ventilert fag. En annen begrensning av teknikken er observerbare i figur 5D-5F hvor data er ikke tilgjengelig på de høyeste konsentrasjonene for klor-eksponerte gruppen fordi tilpasning av Constant fase modell til dataene er dårlig over moderate nivåer av bronkokonstriksjon. Imidlertid kan alvorlig bronchoconstricted dyr skal vurderes ved å analysere Zrs direkte 15, eller ved å bruke tredjeparts post-analyse programvare for å få plass til mer komplekse matematiske modeller, for eksempel tar hensyn til heterogenitet av mekanisk funksjon 17. Ekskluderte datasett kan også observeres hvis dyrets luftveiene er ikke tilstrekkelig passive eller hvis motstanden av kanylen for høyt. Som en tommelfingerregel bør motstanden av kanylen ikke overskride dyrets motstand ved utgangspunktet. Arbeide med en kanyle av større indre diameter og / eller kortere lengde vil bidra til å redusere kanylen motstand. Til slutt kan foreliggende demonstrasjon av FOT målinger i mus bli oppfattet som en tidkrevende og derfor mindre effektiv metode eller mindre anvendelig for longitudinelle studier sammenlignet med mindre invasive teknikker. Men sistnevnte er forbundet med stor usikkerhet knyttet til grunnlaget for sine resultater, og blir sett på av mange som feilaktig en. Gjentatte invasive målinger er mulig i muntlig intubert dyr, selv om teknisk mer utfordrende 17.
Fra eksemplene, viste resultatene at ekvivalensen av de to generasjoner av flexiVent system ved fremstilling av målinger av respiratoriske mekanikk, samt airway hyperreacvitet og overfølsomhet for inhalert methacholine etter klor-eksponering hos mus. Når den brukes til å karakterisere eller forstå fysiologiske forandringer eller sykdom modeller, detaljert måling aspektet knyttet til teknikken kan bidra til å forlenge den nåværende tilstand av kunnskap.
The authors have nothing to disclose.
TKMcG er støttet av en studieplass fra den kanadiske Thoracic Society.
FORFATTERE 'BIDRAG
Alle forfattere deltok i unnfangelsen av manuskriptet. I tillegg TKMcG initiert prosjektet, samlet eksperimentelle resultater, bidro til skriving av manuskript og kritisk gjennomgang. AR samlet og analysert eksperimentelle resultater, utarbeidet manuskriptet og bidratt til dens kritisk gjennomgang. LF samlet eksperimentelle resultater og bidratt til kritisk gjennomgang av manuskriptet. TFS og jgm bidratt til kritisk gjennomgang av manuskriptet.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
REAGENTS | |||
Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A-2251 | Methacholine |
Micro-Adson forceps, serrated 12 cm | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Moria MC31 forceps, serrated-curved | Fine Science Tools | 11370-31 | |
Iris scissors-tough cut, straight 11.5 cm | Fine Science Tools | 14058-11 | |
Spring scissors-2.5 mm blades, straight | Fine Science Tools | 15000-08 | |
Non-sterile blunt needle (18g x ½”) | Brico Medical Supplies Inc. | BN1805 | Endotracheal cannula |
Non-sterile 5-0 silk suture | Seraflex | IDI58000 | |
Phosphate buffered solution | Gibco | 14190-144 | |
15 ml conical tubes | Starstedt | SS-4001 | |
1 ml TB syringes | Becton Dickinson | 309626 | |
200 μl filter tips | Biosphere | 70.760.211 | |
EQUIPMENT | |||
flexiVent FX | SCIREQ Inc. | sales@scireq.com | www.scireq.com |
Aerogen Aeroneb nebulizer | SCIREQ Inc. | sales@scireq.com | www.scireq.com |