Evaluering av polymere Gene levering Nanopartikler av nanopartikler Tracking Analysis og High-throughput flowcytometri

Summary

En protokoll for nanopartikkel sporing analyse (NTA) og high-throughput flowcytometri å vurdere polymere genet levering nanopartikler er beskrevet. NTA utnyttes for å karakterisere nanopartikkel partikkelstørrelsesfordeling og plasmidet per partikkel fordeling. High-throughput flowcytometri gjør kvantitative transfeksjon effektevalueringen for et bibliotek av genet levering biomaterialer.

Abstract

Ikke-virale genet levering hjelp polymere nanopartikler har dukket opp som en attraktiv metode for genterapi for å behandle genetiske sykdommer ¹ og som en teknologi for regenerativ medisin ^2. Motsetning til virus, som har betydelige sikkerhetsaspekter, kan polymere nanopartikler utformes for å være ikke-giftig, ikke-immunogene, ikke-mutagent, enklere å syntetisere, kjemisk allsidig, stand til å bære større nukleinsyre last og biologisk nedbrytbare og / eller miljømessig responsive. Kationiske polymerer selv montere med negativt ladet DNA via elektrostatisk interaksjon for å danne komplekser på størrelsesorden 100 nm som ofte benevnes polymere nanopartikler. Eksempler biomaterialer brukes til å danne nanoskala polykationiske genet levering nanopartikler omfatter polylysin, polyphosphoesters, poly (amidoamines) s og polyetylenimin (PEI), som er en ikke-nedbrytbar off-the-sokkel kationisk polymer som vanligvis brukes for nukleinsyre produksjonstid ^1,3. Poly (beta-aminoester) s (PBAEs) er en nyere klasse av kationiske polymerer ⁴ som er hydrolytisk nedbrytbare ^5,6 og har vist seg å være effektive på genet levering til vanskelig å transfektere celletyper som humane retinale endotelceller (HRECs) ^7, mus mammary epitelceller ^8, menneskelige hjerne kreftceller ⁹ og makrovaskulære (human umbilical vein, HUVECs) endotelceller ^10.

En ny-protokollen for å karakterisere polymere nanopartikler utnytte nanopartikkel sporing analyse (NTA), er beskrevet. I denne tilnærmingen blir både partikkelstørrelsesfordelingen og fordelingen av antall plasmider per partikkel innhentet ^11. I tillegg er en high-throughput 96-brønns plate transfeksjon analysen for rask screening av transfeksjon effekten av polymere nanopartikler presentert. I denne protokollen, er poly (beta-amino-ester) s (PBAEs) brukt som modell polymerer og humane retinal endotelceller (HRECs) brukes som model menneskeceller. Denne protokollen kan lett tilpasses for å evaluere eventuelle polymert nanopartikkel og enhver celletype av interesse i en multi-brønn plate-format.

Introduction

Bestemmelsen av antall plasmider kompleksbundet per nanopartikkel er viktig å utforme effektive nanopartikkel-baserte genet levering strategier, spesielt for co-levering av flere plasmider til samme celle målet, som ofte er nødvendig i stamcelleforskningen omprogrammering studier ^12. Noen tilnærminger for å beregne antall plasmider forbundet med en enkelt nanopartikkel er beskrevet, og hver tilnærming har ulemper i de teknikkene som brukes for estimering ^13-16. Kvante prikk (QD) merking kombinert med TEM har blitt brukt til å beregne plasmider per partikkel i kitosan-baserte nanopartikler. Estimering med dette QD teknikken er komplisert på grunn av behovet for å merke DNA, som kan endre sin selv-montering egenskaper, muligheten for at innkapslet umerket DNA ikke er direkte detektert; potensielt overlappende plasmider og QDs i 2D TEM bilder av partikler, og andre forenklende forutsetninger ^13. En alternativ tilnærming som er enpplicable når bestilt microdomains finnes i partiklene har blitt brukt til å studere Lipopolyamine-DNA komplekser via Cryo-transmisjonselektronmikroskopi (Cryo-TEM), X-ray spredning, og dynamisk lysspredning (DLS) ^14,15. Dessverre, materialer som de polymere nanopartikler undersøkt her er ikke aktuelt med denne metoden. I en annen studie, brukte Collins et al en flyt partikkel bildeanalyse teknikk for å studere (Lys) _{16-inneholdende} peptid / DNA komplekser,. Kan imidlertid deres metode bare vurdere større, mikron-størrelse partikler ^16. Således vi nylig utviklet en ny og fleksibel assay å kvantifisere antallet plasmider pr nanopartikkel ^11.

Protocol

1. Cell Seeding Ikke la cellene til å vokse til overconfluency. Bruk tidlig passasje cellene når transfecting primærceller. Tjuefire timer før transfeksjon, trypsinize cellene, telle cellene ved hjelp av en hemocytometer, og fortynn cellesuspensjonen med media for å oppnå den ønskede celletetthet (celler / volum). Seed celler til klar vevskultur-behandlet flatbunnede 96-brønners plater ved bruk av en reservoar-og flerkanals pipetter. Den valgte tetthet bør gi 70-80% sammenflyting den dagen …

Representative Results

Fig. 1 viser et fluorescensmikroskopi bilde av et eksempel på en vellykket transfeksjon av HRECs med EGFP plasmid. Den lysfelt Bildet er nyttig for å sikre at cellene opprettholde deres vanlige morfologi. Tillegg kan celleviabilitet analyser, for eksempel MTS eller lignende undersøkelser, brukes til å vurdere nanopartikkel toksisitet 7. Flowcytometri, som beskrevet, kan brukes til å kvantifisere transfeksjon effektivitet. Ved bruk av HyperCyt flerbrønns plate vedlegg, vil dataene som m?…

Discussion

Protokollene over beskriver metoder for å evaluere effekten av transfeksjon nanopartikkel formuleringer, så vel som en måte å karakterisere partikkelstørrelsen og DNA lasting av nanopartikler. Antallet plasmider per partikkel er en viktig parameter som kan bidra til å forutsi effektiviteten av partikkelen, og kan også brukes for dosebestemmelse. Nanopartikkel sporing analyse kan utføres i en rekke forskjellige vandige oppløsninger, slik som de forskjellige i saltkonsentrasjonen. Ofte denne karakteristikken er u…

Materials

			Reagent
Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS)	Invitrogen	10010
EGM-2MV BulletKit	Lonza	CC-3202
Trypsin	Invitrogen	25300
Sodium acetate buffer	Sigma-Aldrich	S7899	Dilute to 25mM in deionized water
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855
pEGFP DNA	Elim Biopharmaceuticals	NA
DsRed DNA	Addgene	21718
PEI, branched	Sigma-Aldrich	408727
CellTiter 96 AQueous One	Promega	G3580
			Materials
Clear flat bottom 96-well plate, sterile	Sarstedt	82.1581.001
Clear round bottom 96-well plate, sterile	Sarstedt	82.1582.001
12-channel Finnpipette	Thermo Scientific	NA	5-50 and 50-300 μl
Fluorescence Microscope	Zeiss	NA	Model number: AX10
C6 Accuri flow cytometer	BD Biosciences	NA
HyperCyt attachment	Intellicyt	NA
NS500	Nanosight	NA