السذاجة الكبار الخلايا الجذعية عزل من المرحلة الابتدائية الثقافات الخلايا الليفية الإنسان
Summary
نفيدكم طريقة لعزل السذاجة السلائف الجلد المشتقة (SKP) خلايا متعددة القدرات من الثقافات الخلايا الليفية الإنسان الأساسية. وتبين لنا أن هذه SKPs المستمدة من الثقافات الليفية تقاسم خصائص الخلايا الجذعية مماثلة لتلك التي تستمد مباشرة من خزعات الجلد البشري. هذه الخلايا تعبر عن علامة قمة العصبية، nestin، بالإضافة إلى علامات متعددة القدرات مثل OCT4 وNANOG.
Abstract
على مدى العقد الماضي، وقد تم تحديد العديد من السكان الكبار الخلايا الجذعية في الجلد البشري 1-4. وذكرت والعزلة السلائف متعددة القدرات الجلدي الكبار أول مرة من قبل ميلر F. D مختبر 5، 6. وصف هذه الدراسات في وقت مبكر متعددة القدرات خلية السكان السلائف من الكبار الأدمة الثدييات 5. هذه الخلايا – SKPs يطلق عليه، لالسلائف الجلد المشتقة – تم عزل وتوسيع نطاقها من القوارض وجلد الإنسان ومتباينة في ذرية على حد سواء العصبي وأرومية متوسطة، بما في ذلك أنواع الخلايا أبدا وجدت في الجلد، مثل الخلايا العصبية 5. كشفت الدراسات Immunocytochemical على SKPs مثقف أن الخلايا أعرب vimentin وnestin، وهو بروتين خيوط الوسيطة التي أعرب عنها في السلائف العضلات العصبي والهيكل العظمي، بالإضافة إلى فبرونيكتين ومتعددة القدرات علامات الخلايا الجذعية 6. حتى الآن، وقد تم عزل الخلايا الجذعية البالغة SKPs السكان من جمعها طازجة خزعات الجلد الثدييات.
ve_content "> في الآونة الأخيرة، وقد أنشأنا وذكرت أن عدد سكانها خلايا الجلد السلائف المستمدة يمكن أن تظل موجودة في الثقافات الليفية الأولية التي أنشئت من خزعات الجلد 7. وكان الافتراض أن عدد قليل من الخلايا الجذعية الجسدية قد تتواجد في الثقافات الليفية الأولية في الأضعاف السكان في وقت مبكر بالاستناد إلى الملاحظات التالية: (1) يتم اشتقاق SKPs والثقافات الليفية الأولية من الأدمة، ويمكن أن تظل موجودة في الثقافات الخلايا الليفية الجلدية الأولية وبالتالي عدد قليل من الخلايا SKP و (2) الثقافات الليفية الأولية نمت من مأخوذة المجمدة التي كانت تعرض لدرجة حرارة غير المواتية أثناء التخزين أو النقل يحتوي على عدد صغير من الخلايا التي ظلت قابلة للحياة 7. هذه الخلايا النادرة كانوا قادرين على توسيع ويمكن passaged عدة مرات. اقترح هذه الملاحظة أن عددا صغيرا من الخلايا مع ارتفاع قوة الانتشار ومقاومة للإجهاد كانت موجودة في الثقافات الخلايا الليفية الإنسان 7.ونحن قد استفادت من تلك النتائج إلى وضع بروتوكول لعزل السريع للخلايا الجذعية البالغة من الثقافات الليفية الأولية التي تتوافر بسهولة من بنوك الأنسجة في جميع أنحاء العالم (الشكل 1). هذا الأسلوب له أهمية كبيرة لأنه يتيح للعزل الخلايا السلائف عندما عينات الجلد لا يمكن الوصول إليها في حين الثقافات الليفية قد تكون متاحة من بنوك الأنسجة، وبالتالي، وفتح فرص جديدة لتشريح الآليات الجزيئية الكامنة وراء الأمراض الوراثية النادرة فضلا عن الأمراض النمذجة في طبق.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، السذاجة الخلايا الجذعية عن طريق الجلد يمكن عزلها عن الثقافات الخلايا الليفية الجلدية الأولية. باستخدام هذا النهج، ونحن ذكرت مؤخرا عزل وتوصيف الخلايا الجذعية البالغة من الثقافات الليفية المستمدة من المرضى الذين يعانون من متلازمة ورا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة الكسندر فون همبولت (5090371)، ومركز KUHNE كريستين لأبحاث أمراض الحساسية والتعليم (CK-CARE)، وBayerischen Staatsministerium (دينار كويتي).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. |
References
- Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).
- Watt, F. M., Celso, L. o., C, V., Silva-Vargas, Epidermal stem cells: an update. Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).
- Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. Epithelial stem cells: turning over new leaves. Cell. 128, 445 (2007).
- Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation. Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).
- Fernandes, K. J. L., et al. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells. Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).
- Wenzel, V., et al. Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo. Bio. Open. 1, (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402 (2001).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocol. 1, 2803 (2006).
- Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23, 727 (2005).
- Fernandes, K. J., et al. Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors. Electrophoresis. 201, 32 (2006).
- Hill, l. K. L., et al. Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function. Exp. Hematol. 38, 246 (2010).
