Naïve Adult Stem Cells Aislamiento de Primaria cultivos de fibroblastos humanos

Summary

Se presenta un método para aislar precursoras derivadas de la piel (SKP) células multipotentes ingenuos de cultivos de fibroblastos humanos primarios. Se demuestra que estos SKPs derivados de cultivos de fibroblastos comparten propiedades de células madre similares a los obtenidos directamente a partir de biopsias de piel humana. Estas células expresan el marcador de la cresta neural, nestina, además de los marcadores multipotentes, tales como Oct4 y Nanog.

Abstract

Durante la última década, varias poblaciones de células madre adultas se han identificado en la piel humana ^1-4. El aislamiento de los precursores multipotenciales dérmicos adultos se informó por primera vez por Miller F. D de laboratorio ^{5, 6.} Estos primeros estudios describen una población de células precursoras multipotentes a partir de la dermis de mamífero adulto ^5. Estas células – SKPs denominados precursores, para derivadas de la piel – se aislaron y expandieron a partir de roedores y de la piel humana y se diferencian tanto en la progenie neuronal y mesodérmico, incluyendo tipos de células nunca se encuentran en la piel, tales como las neuronas ^5. Estudios inmunocitoquímicos en SKPs cultivadas revelaron que las células expresan vimentina y nestina, una proteína de filamento intermedio expresado en precursores neuronales y musculares del esqueleto, además de fibronectina y marcadores de células madre multipotentes ^6. Hasta ahora, las células madre adultas SKPs población han sido aislados de recién recogidas biopsias de piel de mamífero.

ve_content "> Recientemente, hemos establecido e informó que una población de células precursoras derivadas piel puede permanecer presente en cultivos de fibroblastos primarios establecidos a partir de biopsias de la piel ^7. La suposición de que algunas células madre somáticas pueden residir en cultivos de fibroblastos primarios en duplicaciones de la población primitiva era basan en las siguientes observaciones: (1) SKPs y cultivos de fibroblastos primarios se derivan de la dermis, y por lo tanto, un pequeño número de células SKP podrían permanecer presente en cultivos de fibroblastos dérmicos primarios y (2) los cultivos primarios de fibroblastos cultivados a partir de alícuotas congelados que han sido sometidos a temperatura desfavorable durante el almacenamiento o transferencia contenía un pequeño número de células que permanecieron viables ^7. Estas células raras fueron capaces de ampliar y se pudo pasar varias veces. Esta observación sugiere que un pequeño número de células con alta potencia de proliferación y la resistencia al estrés estuvieron presentes en cultivos de fibroblastos humanos ^7.

Nos aprovechamos de estos resultados para establecer un protocolo para el aislamiento rápido de las células madre adultas a partir de cultivos primarios de fibroblastos que son fácilmente disponibles en los bancos de tejidos de todo el mundo (Figura 1). Este método tiene un significado importante, ya que permite el aislamiento de las células precursoras cuando las muestras de piel no son accesibles mientras que cultivos de fibroblastos pueden estar disponibles en los bancos de tejidos, por lo tanto, la apertura de nuevas oportunidades para diseccionar los mecanismos moleculares que subyacen a enfermedades genéticas raras, así como enfermedades de modelado en un plato.

Protocol

1. Aislamiento SKP de cultivos de fibroblastos primarios Cultivos de fibroblastos ya sea de bancos de células o directamente obtenido a partir de biopsias de la piel se mantienen en cultivo en un medio de crecimiento de fibroblastos DMEM que contenía 15% de suero de ternera fetal, 2 mM de glutamina, 10 mg / ml de penicilina, y 10 mg / ml de estreptomicina. Fibroblastos humanos GMO3349C y GMO8398A se obtuvieron del Instituto Coriell de Investigación Médica (Camden, Nueva …

Representative Results

Se demuestra que una población de células que se expanden selectivamente para generar esferas SKP bajo condiciones de crecimiento controlado que consisten en EGF y FGF2 están presentes en cultivos de fibroblastos dérmicos primarios (Figura 1) como se informó recientemente 7. Cultivos de fibroblastos de PPD 15 a 25 que normalmente se corresponden con las cepas de fibroblastos primarios disponibles a partir de bancos de células se utilizaron en este estudio. C…

Discussion

Utilizando el método descrito en este documento, las células madre dérmicas ingenuos se pueden aislar a partir de cultivos primarios de fibroblastos dérmicos. Con este enfoque, se informó recientemente, el aislamiento y caracterización de células madre adultas de cultivos de fibroblastos procedentes de pacientes con un síndrome genético raro, Hutchinson-Gilford progeria síndrome ^7. Como se muestran en este documento esos precursores células expresan marcadores de células madre son capaces de auto-…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM high glucose	Invitrogen	31966-047
DMEM low glucose	Invitrogen	21885-108
fetal bovine serum	Invitrogen	10270-106
L-glutamine	Invitrogen	25030-024	Final conc.: 200 mM
Penicillin/ Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml
trypsin solution (0.25%)	Invitrogen	25200-056
F-12 Nutrient Mixture (Ham)	Invitrogen	21765-029
FGF2	BD Biosciences	4114-TC-01M	Final conc.: 40 ng/ml
EGF	BD Biosciences	236-EG-200	Final conc.: 20 ng/ml
PDGFBB	Invitrogen	PHG0043	Final conc.: 5 ng/ml
TGF-b1	Invitrogen	PHG9204	Final conc.: 2.5 ng/ml
25 cm2 flask	Omnilab	FALC353109
PBS w/o CaMg	Invitrogen	14190-169
B27	Invitrogen	17504-044
Methanol	Roth	8388.2
Vectashield mounting medium	Vector Inc.	H-1200
RNeasy Minikit	Qiagen, Valencia, CA	74104
Omniscript Reverse Transcriptase	Qiagen	205113
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	172-5201
Fungizone	Invitrogen	15290-018	Final conc.:1 mg/ml
			Table 2. Specific reagents and equipment.