Naiv Vuxna stamceller Isolering från primära humana fibroblastkulturer
Summary
Vi rapporterar en metod för att isolera naiva multipotenta hud-derived prekursorer (SKP) celler från primära humana fibroblastkulturer. Vi visar att dessa SKPs härrör från fibroblastkulturer delar liknande egenskaper stamceller till de som härrör direkt från mänsklig hud biopsier. Dessa celler uttrycker neurallisten markör, nestin, förutom de multipotenta markörer såsom Oct4 och Nanog.
Abstract
Under det senaste decenniet har flera vuxna stamceller har identifierats i human hud 1-4. Isoleringen av multipotenta vuxna dermal prekursorer rapporterades först av Miller F. D laboratoriet 5, 6. Dessa tidiga studier beskrivs en multipotent befolkning prekursorcell från vuxna däggdjur dermis 5. Dessa celler – kallade SKPs, för hud-härledda prekursorer – isolerades och expanderades från gnagare och mänsklig hud och differentieras till både neurala och mesodermal avkomma, inklusive celltyper aldrig hittats i huden, till exempel nervceller 5. Immunocytokemiska studier på odlade SKPs avslöjade att celler uttryckte vimentin och nestin, ett mellanliggande filament protein uttryckt i neurala och skelettmuskel prekursorer, förutom fibronektin och multipotenta stamceller markörer cellen 6. Hittills har de adulta stamceller befolkningen SKPs isolerats från nyuppsamlade däggdjur hudbiopsier.
ve_content "> Nyligen har vi etablerat och rapporterade att en population av hud härledda prekursorceller kan finnas kvar i primära fibroblastkulturer etablerade från hudbiopsier 7. Antagandet att några somatiska stamceller kan bosätta sig i primära fibroblastkulturer vid tidiga populationsfördubblingar var bygger på följande iakttagelser: (1) SKPs och primära kulturer fibroblaster härstammar från dermis, och därmed ett litet antal SKP celler kan finnas kvar i primära dermala fibroblastkulturer och (2) primära fibroblastkulturer vuxit från frysta portioner som har varit utsätts för ogynnsamma temperatur under lagring eller överföring innehöll ett litet antal celler som förblev lönsamt 7. Dessa sällsynta celler kunde expandera och kunde passera flera gånger. Denna observation föreslog att ett litet antal celler med hög spridning potens och motståndskraft mot stress var närvarande i humana fibroblastkulturer 7.Vi drog fördel av dessa resultat att upprätta ett protokoll för snabb isolering av adulta stamceller från primära fibroblastkulturer som är lätt tillgängliga från vävnad banker runt om i världen (figur 1). Denna metod har viktig betydelse eftersom den möjliggör isolering av prekursorceller när hudprover är inte tillgängliga när fibroblastkulturer kan vara tillgängliga från vävnadsbanker, alltså, öppnar nya möjligheter för att dissekera de molekylära mekanismerna bakom sällsynta genetiska sjukdomar samt sjukdomar modellering i en skålen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med användning av metoden som beskrivs häri, kan naiva dermala stamceller isoleras från primära dermala fibroblastkulturer. Med hjälp av denna metod, rapporterade vi nyligen isolering och karaktärisering av adulta stamceller från fibroblastkulturer härledda från patienter med en sällsynt genetisk syndrom, Hutchinson-Gilford progeria syndrom 7. Som visar här de precursorceller uttryckliga stamceller markörer klarar av själv-förnyande och kan riktas för att differentiera till olika cellulära hä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Alexander von Humboldt-stiftelsen (5090371), den Christine Kühne Centrum för allergiforskning och utbildning (CK-CARE), och Bayerischen Staatsministerium (KD).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. |
References
- Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).
- Watt, F. M., Celso, L. o., C, V., Silva-Vargas, Epidermal stem cells: an update. Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).
- Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. Epithelial stem cells: turning over new leaves. Cell. 128, 445 (2007).
- Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation. Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).
- Fernandes, K. J. L., et al. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells. Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).
- Wenzel, V., et al. Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo. Bio. Open. 1, (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402 (2001).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocol. 1, 2803 (2006).
- Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23, 727 (2005).
- Fernandes, K. J., et al. Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors. Electrophoresis. 201, 32 (2006).
- Hill, l. K. L., et al. Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function. Exp. Hematol. 38, 246 (2010).
