采用实时定量PCR检测供体细胞植入一个具有竞争力的小鼠骨髓移植模型
Summary
确定供体细胞移植在小鼠骨髓移植模型中，缺乏定义的表型标记提出了挑战。我们描述了一种方法来量化男性捐赠者的细胞植入女性移植受体小鼠。此方法可用于研究HSC功能在所有的小鼠品系。
Abstract
小鼠骨髓移植模型提供了一个重要的工具，在测量造血干细胞（HSC）功能，并确定基因/分子，调节造血干细胞。在这些移植模型系统，是由这些细胞的能力，嫁接和重组致死剂量照射的受体小鼠的造血干细胞的功能。一般情况下，供体细胞的贡献/植活测定用流式细胞仪供体特异性的细胞表面蛋白的抗体。然而，该方法在很大程度上依赖于特异性和区分来自供体的细胞的细胞表面标志物的能力，从收件人起源的细胞，这可能不是可用于所有的小鼠品系。考虑到各种不同的背景在市场上的转基因小鼠品系，该细胞表面/流量流式细胞仪为基础的方法具有显着的局限性，特别是在缺少界定良好的从同类系收件人策单独的供体细胞的表面标志物的小鼠品系LLS。在这里，我们报道了基于PCR的技术来确定移植的受体小鼠的体细胞移植/贡献。男性捐赠者的骨髓造血干细胞移植到致死剂量照射的同源雌性小鼠。在不同时间点移植后外周血标本收集。在实验结束后获得的骨髓标本。分离基因组DNA和Y染色体的特定基因，Zfy1，采用实时定量PCR扩增。在女性受体小鼠的植入男性捐赠者来源的细胞对标准曲线的男性与女性的DNA与已知的百分比计算。 Bcl2蛋白被用作参照基因正常化的总DNA量。我们的数据表明，这种方法可靠地确定供体细胞植入，并提供了一个有用的，但简单的方法，测量造血干细胞重建小鼠骨髓移植模型。我们的方法可以在大多数实验室常规进行的，因为没有需要昂贵的设备，如流式细胞仪。
Introduction
小鼠骨髓（BM）移植模型最早是在20世纪60年代1。这个模型已被广泛用于造血干细胞（HSC）在宿主受体小鼠的生物学研究。小鼠骨髓移植模型为我们提供了宝贵的知识HSC功能及其调控，造血干细胞的研究是必不可少的。异基因骨髓移植模型，例如C57BL/6J H2B-BALB / C的H2D或同源移植模型如C56Bl/6J CD45.2 B6.SJL CD45.1中使用的许多实验室研究基因的功能，影响HSC活动2 HSC功能3或移植相关的疾病，如移植物抗宿主病（GvHD）4上的药物治疗。
通常用于区分来自供体的细胞，从收件人-起源的细胞的细胞表面标志物，如MHC单倍型或CD45.1。 C57BL/6J H2B，CD45.2 </suP>，BALB / C H2D和B6.SJL的CD45.1是最常用的小鼠品系，在骨髓移植的供体细胞的贡献，因为可以很容易地用流式细胞仪，CD45.1 与 CD45.2或H2B与评估H2D。 FVB / NJ 5 C3H然而，许多其他菌株也经常被用来生成基因工程转基因或基因敲除小鼠。这些小鼠可回交自交系和保持在混合的遗传/ MHC背景。在这种情况下，确定供体细胞移植和造血干细胞的功能可能是困难的，因为供体特异性的细胞表面标志物可能无法使用。
Y-染色体特异DNA探针来检测Southern杂交性别不匹配的骨髓移植供体雄性细胞最早是由美和博士的研究小组6。然后，在实时PCR的性别决定区Y被认为是准确的和高度特异性的方法来定量毫安乐胎儿细胞在母体血液系统7。这个概念被改编由博士Schwarzenberger的研究小组开发的实时PCR技术在小鼠骨髓移植模型，以确定供体细胞植入8。我们进一步修改FVB / NJ小鼠骨髓移植模型中的体细胞移植的测量方法。这种方法是目前广泛使用于本集团PIM1激酶在造血干细胞生物学作用的研究。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们目前的研究目标是提供观众一个基于PCR技术定量供体细胞移植在竞争激烈的小鼠骨髓移植模型。一些研究已经用RT-PCR检测供体细胞移植模型9-10。第一博士Schwarzenberger的研究小组开发出了小鼠骨髓移植模型，采用实时PCR扩增Y染色体特定的8。这种方法被用来研究GLI-1在造血干细胞的功能活动11。然后，我们进一步修改了协议，在可视化的格式，并提供了一个详细的，…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢查尔斯·格林伯格博士利用他的实时PCR仪。 MUSC霍林斯癌症中心的启动资金，霍林斯癌症中心的ACS IRG，ASCO征服癌症基金会事业发展奖，美国国立卫生研究院1K08HL 103780-01A1，和美国国立卫生研究院3P30CA138313-01S3这项工作是支持的。的内容完全是作者的责任，并不一定代表官方意见的国家机构的健康或其他资金剂。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
References
- McCulloch, E. A., Till, J. E. The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice. Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119, 4898-4907 (2012).
- Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model. PLoS One. 5, e11316 (2010).
- Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
- Taketo, M., et al. FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).
- Morisaki, H., et al. Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation. Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).
- Lo, Y. M., et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).
- Byrne, P., et al. Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR. Biotechniques. 32, 279-280 (2002).
- Ma, X., et al. Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation. PLoS One. 3, e1894 (2008).
- Bosio, E., et al. A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation. Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).
- Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors. Blood. 115, 2391-2396 (2010).
- Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues. Genes & development. 4, 63-74 (1990).
- Grundler, R., et al. Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration. J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).
