Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen afkomstig van genetisch gemanipuleerde muizen met borstkanker te bepalen of er correlaties tussen specifieke gedragsparameters en verschillende genetische laesies beoordelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Time-lapse imaging of Primary preneoplastische uier epitheelcellen afkomstig van de genetisch gemanipuleerde muis modellen van borstkanker
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Time-lapse imaging kunnen worden gebruikt om het gedrag van gekweekte primaire preneoplastische mammaire epitheelcellen uit verschillende genetisch gemanipuleerde muizen modellen van borstkanker te vergelijken. Zo kan tijd tussen celdelingen (cel levensduur), apoptotische aantal cellen, evolutie van morfologische veranderingen, en het mechanisme van kolonievorming worden gekwantificeerd en vergeleken cellen die specifieke genetische lesies. Primaire borstklier epitheliale celculturen worden gegenereerd uit melkklieren, zonder voelbare tumor. Klieren zijn zorgvuldig gereseceerd met duidelijke scheiding van aangrenzende spieren, worden lymfeklieren verwijderd, en single-cell suspensies van verrijkte borstklier epitheliale cellen worden gegenereerd door hakken borstweefsel gevolgd door enzymatische dissociatie en filtratie. Eencellige suspensies worden uitgeplaat en direct onder een microscoop in een incubator kamer voor levende cellen imaging. Zestien 650 um x 700 urn velden in een 4x4-configuratie van elk well van een 6-well plaat belicht worden elke 15 minuten gedurende 5 dagen. Time-lapse beelden worden onderzocht rechtstreeks cellulaire gedrag dat mechanisme en de frequentie van kolonievorming cellen kunnen bestaan binnen de eerste 24 uur van het uitplaten van de cellen (aggregatie versus celproliferatie), incidentie van apoptose en fasering van morfologische veranderingen te meten. Single-cell tracking wordt gebruikt om lot van de cel kaarten voor het meten van individuele cel levens en het onderzoek van de celdeling patronen te genereren. Kwantitatieve gegevens worden statistisch geanalyseerd voor de evaluatie significante verschillen in gedrag gecorreleerd met specifieke genetische lesies.
Inleiding
Genetisch gemanipuleerde muismodellen zijn instrumenten te bestuderen en te begrijpen hoe verschillende genetische afwijkingen bijdragen aan het risico op het ontwikkelen van borstkanker. Bijvoorbeeld genetisch gemanipuleerde muizen aangetoond dat de combinatie van drie factoren: verlies van de volledige lengte borstkanker 1, early onset (BRCA1) gen in mammaire epitheelcellen, p53 tumor (TP53) germinale haploinsufficiëntie en mammaire epitheliale cel gerichte upgereguleerd oestrogeen receptor alpha (ERa) expressie resulteert in de ontwikkeling van borstkanker in 100% van BRCA1 floxed (f) 11/f11/Mouse borsttumorvirus (MMTV) -Cre/p53 + / -/te....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Algemene Regeling
- Genereren primaire kweken van preneoplastische mammaire epitheelcellen melkklieren van genetisch gemanipuleerde en controle wild-type muizen.
- Het mogelijk 'live-cell beelden elke 15 min met behulp van Volocity beeld acquisitie software (versie 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) voor maximaal 5 dagen.
- Direct bekijken time-lapse beelden naar de timing en het mechanisme van epitheliale cellen kolonievorming, incidentie van apoptose, en fasering van morfologische veranderingen te beoordelen.
- Converteer gegenereerd Volocity. TIFF stacks aan. JPG-bestanden met behulp van Metamorph Microscopie Automation ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Epitheliale en fibroblast cellen kunnen worden onderscheiden door celmorfologie. Epitheelcellen een kubische vorm (Figuur 1A-B) en vorm celkolonies (Figuur 1A). Fibroblasten, een type stromale cellen, een langwerpige morfologie (figuur 1C).
Cellen werden afgerond en drijven bij het begin van imaging (figuur 2A-D). Na bevestiging aan de plaat werden ze plat en toonde een kubische-type weergave (figuur 2E, H).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kritische stappen
Het is belangrijk dat melkklieren worden geoogst uit muizen van dezelfde leeftijd te controleren voor leeftijdsgerelateerde variabiliteit in mammaire epitheelcellen gedrag. Bij uitplaten van de cellen, moet hetzelfde aantal cellen worden uitgeplaat in elk putje voor elk experiment. Cellen moeten relatief dun als plateren zodat culturen worden niet confluent te snel waardoor het mogelijk meerdere individuele cellen volgen door seriële beelden. Het is essentieel dat de plaat in .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Bofan Wu en christelijke Raithel bedanken voor technische bijstand en Michael Rieger voor zijn kennismaking met live-cell imaging. Ondersteund door NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 Ref. 316 (REN), Ministerie van Defensie W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) programma via de National Research Foundation van Korea gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologie (R31-10069) (PAF ), NIH IG20 RR025828-01 (Knaagdieren Barrier Facility Equipment) en NIH NCI 5P30CA051008 (Microscopie en Imaging en Animal Gedeelde bronnen).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van de Reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| EpiCult-B Basal Medium Mouse | StemCell Technologies | 05610 | |
| EpiCult-B proliferatieverdrag Supplementen Mouse | StemCell Technologies | 05612 | |
| recombinant humane epidermale groeifactor (rhEGF) | StemCell Technologies | 02633 | |
| Collagenase / Hyaluronidase | StemCell Technologies | 07912 | |
| Wegwerp Scapels | Veer | 2975 # 10 | |
| Balanced Salt Hanks 'oplossing | StemCell Technologies | 37150 | |
| Eenmmonium Chloride | StemCell Technologies | 07800 | |
| Tryspin-EDTA | StemCell Technologies | 07901 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 07913 | |
| DNase I | StemCell Technologies | 07900 | |
| 40 urn celzeef | StemCell Technologies | 27305 | |
| FBS | StemCell Technologies | 06100 | |
| Penstrep | Gibco | 15140 |
Referenties
- Jones, L. P., et al. Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer. Oncogene. 27, 794-802 (2008).
- Burga, L. N., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
