Her præsenterer vi en elektrofysiologisk metode baseret på solide understøttede membraner med fokus på deres ansøgninger om karakterisering af elektroanalysen membran transportproteiner.
Den elektrofysiologiske metode præsenterer vi bygger på et solidt understøttet membran (SSM) bestående af et octadecanethiol lag kemisorberes på en guldbelagt sensor chip og en phosphatidylcholin monolag på toppen. Denne er monteret i en kuvette indeholdende reference elektrode, en chloreret sølvtråd.
Efter adsorption af membranfragmenter eller proteoliposomer indeholdende membranprotein af interesse, er en hurtig løsning udveksling anvendt til at inducere transport aktivitet membranprotein. I de enkelt løsning udvekslingsregelsæt to løsninger, er en ikke-aktiverende og én aktiverende løsning nødvendig. Strømningen styres af trykluft og en ventil og slange-system inden for et Faradays bur.
Kinetikken for elektroanalysen transport aktivitet opnås via kapacitiv kobling mellem SSM og proteoliposomer eller membranfragmenter. Fremgangsmåden er derfor kun giver transient strømme. Spidsstrømmen repræsenterer den stationære transport aktivitet. De tidsafhængige transporter strømme kan rekonstrueres ved kredsløb analyse.
Denne metode er især velegnet til prokaryote transportører eller eukaryote transportører fra intracellulære membraner, som ikke kan undersøges af patch clamp eller spændingsklemme metoder.
Her viser vi en ny elektrofysiologiske tilgang baseret på et solidt understøttet membran (SSM) til karakterisering af elektroanalysen membranproteiner.
Det faste underlag består af et tyndt lag guld på en glasplade, sensorchippen. Den hydrofile guld overflade bruges til at binde thiolgruppe af en alcanethiol reagens. Bagefter selfassembly af phosphatidylcholin monolyer fuldender dannelsen af SSM.
At måle elektrogen reaktioner membranproteiner, er proteoliposomer eller membranfragmenter adsorberet til SSM (figur 1). Proteinet indeholder membranen og SSM så danne en kapacitivt koblet membran-system. Derfor kan ladning translokation på proteinholdige membranen påvises ved kapacitiv kobling via SSM. Denne metode giver kun forbigående strømme. Spidsstrømmen repræsenterer den stationære transport aktivitet. Den tidsafhængige transportør currents kan rekonstrueres ved kredsløb analyse.
Sensorchippen er monteret i en kuvette (figur 2). Kuvetten har en cylindrisk kuvette volumen på 17 pi (nettovolumen med o-ring monteret). En fjeder kontakt pin skaber kontakten til forstærkeren. Et udløb stik er skruet til toppen af hoveddelen og bærer reference elektrode, en chloreret sølvtråd.
Kuvetten er monteret i et Faradays bur. Den er forbundet til en fluid vej, der anvendes til at inducere transport aktivitet af membranprotein i respons på en hurtig løsning udveksling (figur 3). I de enkelt løsning udvekslingsregelsæt to løsninger, er en ikke-aktiverende og én aktiverende løsning nødvendig. Strømmen styres af trykluft ved hjælp af en ventil kontrol software på en computer eller manuelle kontakter på et interface kassen.
1.. Fordele ved SSM-baserede elektrofysiologi sammenlignet med konventionelle metoder
SSM-baserede elektrofysiologi har vist sig som et værdifuldt redskab for elektrofysiologiske værktøjskasse. Det er især nyttigt i tilfælde, hvor konventionen elektrofysiologi, nemlig patch clamp og spænding clamp metoder ikke kan anvendes: Bortset fra nogle få undtagelser bakterielle transportører kan ikke undersøgt ved hjælp spænding klemme eller patch clamp metoder på grund af den lille størrelse af bakterier, og fordi de er vanskelige at udtrykke i mammale celler eller oocyter. Men også fysiologisk relevante pattedyr transportører kan undersøges. I dette tilfælde SSM-baserede elektrofysiologi er attraktivt for transportvirksomheder fra intracellulære membraner og til screening applikationer i lægemiddelforskning på grund af dens robusthed og dens potentiale for automatisering.
SSM-basedUsing konventionelle elektrofysiologi, tidsopløst karakterisering af transporters er udfordrende. Da omsætningen af transportvirksomheder er lav et "kæmpe patch« eller en »hel celle 'konfiguration er nødvendig, som har en iboende lav tidsopløsning i en opløsning udveksling eksperiment. Komplikation kan overvindes ved hjælp af fotolytisk substrat frigivelse. Det er dog kun et begrænset antal substrater velegnet til denne fremgangsmåde. Her hurtig løsning udveksling på SSM giver en unik mulighed for at udføre elektrofysiologiske studier med en høj tidsopløsning hjælp vilkårlige substrater.
2.. Begrænsninger og kritiske trin
I modsætning til patch clamp og spændingsklemme teknikker, kan SSM-baserede elektrofysiologi ikke anvendes til at påføre et potentiale. Transporter karakterisering er derfor begrænset til transportformer, der ikke er afhængige af en membran potentiale.
Generelt har SSM-baserede elektrofysiologi ingen begrænsninger vedrørende type (elektrogen) transportvirksomheden. Men spænding clamp eller patch clamp metoder kan have fordele, hvis intracellulære komponenter som bindende proteiner er nødvendige for protein funktionalitet.
Begrænsninger kan opstå, hvis løsning udveksling skaber store artefakt strømme. Dette sker, når substratet vekselvirker kraftigt med SSM ligesom i tilfælde af lipofile forbindelser. Artifact kontroller kan bruges til at korrigere de målte signaler. Desuden højt saltindhold baggrund i alle måle buffere kan anvendes til at reducere artefakter. Men i tilfælde, hvor størrelsen af den artefakt er sammenlignelig med det protein-signalet, er det næsten umuligt at isolere proteinet relaterede signal fra artefakt. Heldigvis høje artefakter er usædvanligt i en optimeret løsning udveksling.
Der er et par skridt, der er afgørende for en succesfuld realisering af en SSM-baserede elektrofysiologi eksperiment. Fremstillingen af proteinet prøven er den vigtigste del. Hvis proteoliposomer er brugt, skal du sørge for reconsprostitution processen giver en ren, reproducerbar prøve af en tilstrækkelig LPR og transportøren er orienteret på den rigtige måde. LPR kan kontrolleres ved fryse fraktur elektronmikroskopi og orientering ved en ELISA-eksperiment hvis antistoffer er tilgængelige.
Brug kun en SSM der viser optimale parametre for inkubere protein prøven. Indsprøjtning af proteinet er endnu et vigtigt skridt. Lydbehandling er afgørende og luftbobler bør undgås under injektionen. Efter Prøveinkubation målingerne selv er kritisk, fordi luftbobler vil fjerne den adsorberede protein prøven fra sensoren chip. Derfor altid fjerne luftbobler efter skift løsninger. Alligevel et signal nedtrapning kan forekomme. For at rette en mulig signal nedslidt, er det vigtigt at udrette nedslidte kontrol under eksperimentet.
3.. Specialiserede systemer
SSM-opsætning, kan ændres i henhold til dens anvendelse. Desuden ther er helt forskellige, højt specialiserede opsætninger til rådighed.
Der er mulighed for at måle protein signaler under asymmetriske forhold, f.eks under en pH-gradient. At etablere asymmetriske puffersammensætninger i og uden for proteoliposomer en tredje løsning, den hvilende løsning, der skal indføres, og dette kræver en dobbelt udveksling konfiguration. Her yderligere trevejsventil skifte mellem ikke-aktiverende og hvilende løsninger er påkrævet.
At øge den tid resolution af systemet udviklede vi et alternativt flow vej mangler terminalen ventil, men ved hjælp af en anden type kuvette. Her krydset af aktiverende og ikke-aktiverende opløsning er placeret inde i kuvetten, 3 mm foran SSM. Denne opsætning er velegnet til kinetisk analyse af hurtige transportprocesser. Det kunne påvises, at en tidsopløsning så lav som 2 msek er mulig.
Kommerciel fully automatiserede systemer er tilgængelige sigte på et væsentligt højere gennemløb for narkotika screening. En bevægelig enhed indsamler løsninger og sprøjter dem på sensorens overflade i plader med 96 brønde i en standard mikrotiterplade format.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker J. Garcia-Celma jeg Smirnova og R. Kaback for bidrag til lacy målinger og E. Bamberg for støtte og nyttige diskussioner.
Materials | |||
Waterbath Sonicator | Bandelin | RK 52 H | |
Tip Sonicator | Hielscher Ultrasonics GmbH | UP50H | |
2-way valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T011 | |
Terminal valve | NResearch, West Caldwell, USA | NR225T031 | |
Manometer | Greisinger electronics | GDH 14 AN | |
Faraday cage | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Cuvette | Max Planck Institute of Biophysics | ||
100 ml solution containers | Kartell | 1623 | |
O-rings | Seal Science Inc. | ||
Oscilloscope | Tektronix | TDS 1002 | |
Reference electrode | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Function generator | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Tubings | SAINT-GOBAIN Performance Plastics | AAC00006 | |
Sensor chip | Fraunhofer Institut für Schicht und Oberflächentechnik | ||
Interface box | Max Planck Institute of Biophysics | ||
Amplifier | Keithley | 427 | |
Manual cog | Vygon GmbH | 876 | |
USB analog-to-digital converter | National Instruments | 6009 | |
Regeants | |||
1,2‑Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | |
Acrylamide/Bis-acrylamide | Sigma Aldrich | A3574 | |
Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43819 | |
Ethanol absolut | VWR AnalaR NORMAPUR | 603-002-00-5 | |
Natural E. coli lipids polar extract | Avanti Polar Lipids, Inc. | 100600 | for LacY reconstitution |
n-Decane | Sigma Aldrich | D901 | |
Octadecanethiol | Sigma Aldrich | O1858 | |
Octadecylamine | Sigma Aldrich | 74750 | |
Potassium chloride | Merck | 1049360500 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P3786 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
Tetramethylethylenediamine | BIO RAD | 1610801 | |
α-Lactose monohydrate | Sigma Aldrich | L8783 |