Summary
Laser mikrodisseksjon er en teknikk som tillater utvinningen av utvalgte celler fra små mengder av parenchyma. Her beskriver vi en protokoll for å anskaffe humane pankreatiske øyer fra kirurgiske prøver som skal brukes til transcriptomic studier. Vår protokoll forbedrer den iboende autofluorescens av menneskelige beta-cellene, og dermed tilrettelegge sin samling.
Abstract
Laser mikrodisseksjon (LMD) er en teknikk som gjør at utvinning av utvalgte celler og vev fra små mengder av parenchyma 1,2. Den dissekerte celler kan brukes for en rekke undersøkelser, for eksempel transcriptomic eller proteomikk studier, DNA vurdering eller kromosomal analyse 2,3. En spesielt utfordrende anvendelse av LMD er transkriptom analysen, som, på grunn av labilitet av RNA 4, kan være spesielt fremtredende når cellene dissekert fra vev som er rike på RNases som bukspyttkjertelen. En mikrodisseksjon protokoll som muliggjør rask identifisering og innsamling av målcellene er viktig i denne innstillingen for å forkorte vev håndtering tid og dermed å sikre RNA bevaring.
Her beskriver vi en protokoll for å anskaffe menneskelige bukspyttkjertelens betaceller fra kirurgiske prøver som skal brukes for transcriptomic studier fem. Små biter av bukspyttkjertelen på ca 0,5 til 1 cm 3 ble kuttet fra de sunne vises marginene reseksjon bukspyttkjertel prøver, innebygd i Tissue-Tek oktober Compound, umiddelbart frosset i kjølt 2-metylbutan, og lagret ved -80 ° C til snitting. Førti seriesnitt av 10 um tykkelse ble kuttet på en kryostat under en -20 ° C-innstillingen, overført individuelt til glassplater, tørkes inne i kryostaten i 1-2 min, og lagret ved -80 ° C.
Umiddelbart før laser mikrodisseksjon prosedyren ble deler fast i iskald, tilberedes 70% etanol i 30 sek, vasket med 5-6 fall i iskald DEPC-behandlet vann, og dehydrert av to ett-minutts inkubasjoner i iskaldt 100% etanol etterfulgt av xylen (som brukes for vev dehydrering) etter 4 min; vevssnitt ble deretter lufttørket etterpå i 3-5 min. Viktigere, alle trinnene, bortsett inkubasjonen i xylen, som ble utført med iskalde reagenser - en modifikasjon over en tidligere beskrevet protokoll 6. Utilization iskald reagenser resulterte i en markant økning av den indre autofluorescens av beta-cellene, og tilrettelagt deres anerkjennelse. For mikrodisseksjon, var fire seksjoner dehydrert hver gang: to ble plassert i en folie-innpakket 50 ml tube, for å beskytte vev fra fuktighet og bleking, og de resterende to ble umiddelbart microdissected. Denne prosedyren ble utført ved hjelp av en PALM Microbeam instrument (Zeiss) ansette Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC)-modus. Ferdigstillelse av beta celle / holme disseksjon fra fire cryosections kreves ikke lenger enn 40-60 min. Celler ble samlet i en AdhesiveCap og lysert med 10 ul lyseringsbuffer. Hver enkelt RNA prøven for transcriptomic analyse ble oppnådd ved å kombinere 10 celle microdissected prøver, etterfulgt av RNA ekstraksjon med Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Denne protokollen forbedrer den iboende autofluorescens av menneskelige beta-cellene, og dermed tilrettelegge deres raske og nøyaktige anerkjennelse og collection. Ytterligere forbedring av denne fremgangsmåten kan muliggjøre disseksjon av fenotypisk forskjellige beta-celler, med mulige implikasjoner for bedre forståelse av endringer forbundet med type 2-diabetes.
Protocol
1. Frysing av Human pankreasvevet
- Fjern fettvev, blodkar, nerver og ikke-parenchymal vev med en skalpell og pinsett, og kutt pankreasvevet i biter (~ 0,5 til 1 cm terninger).
- Plasser en pankreasvevet brikke i sentrum av en Cryomold, og dekke det helt med kaldt Tissue-Tek oktober Compound. Sett Cryomold i en krukke som bunnen er dekket med pre-avkjølte 2-metylbutan og snap-freeze i flytende nitrogen. Oppbevar frosne prøven ved -80 ° C.
2. Utarbeidelse av Frozen Seksjoner
- Slitasje hansker gjennom alle trinnene for å unngå denaturering av RNA.
- Rengjør kryostaten kniv, prøveholder og pensel med kaldt 100% etanol og RNase Away. Plasser det frosne vev inne i kryostaten.
- Vent til vevet, kniv og pensel nå -20 ° C. Merke SuperFrost Plus lysbilder og pre-cool dem inne i kryostaten kammeret mens du venterfor vev å nå -20 ° C.
- Påfør Tissue-Tek oktober Compound på prøveholderen og legg den frosne vev på toppen.
- Når vevet-Tek oktober Compound er frosset trimme cryoblock og fjerne overflødig Tissue-Tek oktober Compound med et barberblad.
- Skjær totalt 40 sammenhengende 10 mikrometer skiver fra pankreasvevet blokken. I tillegg anbefaler vi å kutte en for-og mellomnavn stykke å bli frelst for oversikt tegninger av bukspyttkjertelen delen som kan lette identifiseringen av holmer innenfor sektorene under mikrodisseksjon prosessen.
- Overfør seksjoner fra knivbladet til sentrum av en SuperFrost Plus lysbilde ved å berøre baksiden av raset med fingeren (dekket med en hanske) for å varme opp bare hvilken region seksjonen skal følge.
- Tørk seksjoner 1-2 min inne i kryostaten ved -20 ° C, hvoretter du setter dem inn i et lysbilde boks plassert på tørris. Oppbevar deleneved -80 ° C.
- Hvis det er nødvendig, rengjør kniven med papirhåndklær og kaldt 100% etanol.
3. Dehydrering av Frozen Seksjoner
- Forbered Reagenser: pour 30 ml nylaget 70% etanol, 30 ml DEPC-behandlet vann, 2x30 ml 100% etanol og 30 ml xylen i 50 ml Cellstar rør (Falcons), chill og holde alle reagenser (unntatt xylen) på is.
- Rengjør arbeidsområde under panseret med 100% etanol og RNaseZAP.
- Prosessen to cryosections som følger: fikse på iskald 70% etanol i 30 sek, vask med 5-6 raske fall i iskald DEPC-behandlet vann, tørke to ganger i 1 min i iskaldt 100% etanol, inkuberes i 4 min i xylen ved romtemperatur (25 ° C) og la dem lufttørke i 3-5 min. Gjenta dette trinnet med et annet par cryosections.
- Sette inn to tørkede cryosections rygg mot rygg til en 50 ml Cellstar rør innpakket i aluminiumsfolie for å beskytte dem mot lys og fuktighet.
- Rengjør mikroskop med RNaseZAP og monter Adhesive Cap i RoboMover.
- Angi følgende innstillinger: Filter sett 09 (eksitasjon: 450-490 nm, utslipp> 515 nm), AutoLPC modus, 50% laser energi, 65% laser fokus, 100% laser hastighet, 5 mikrometer avstand mellom AutoLPC skudd, 6 mikrometer avstand til linje, arbeidshøyde: -10100.
- Sett den ene glir inn på scenen.
- Finne autofluorescent beta celler under mikroskopisk visualisering (5x eller 10x objektiv).
- Bytte til 40x objektivet, velger beta-cellene med "Freehand" markeringsverktøy og microdissect dem ved hjelp av laser.
- Fang vev av fire dehydrerte cryosections i ett AdhesiveCap.
Kommentar 1: tid til å dissekere betacellene en dehydrert cryosection bør ikke være lenger enn 10-20 min for å unngå utvanning av vevsdelene som ville resultere iRNA degradering.
Kommentar 2: bekrefte vellykket mikrodisseksjon prosessen ved visuell inspeksjon etter flytting scenen til sjekkpunkt.
5. Lysis av Microdissected Beta Cell Enriched Tissue
- Fjerne AdhesiveCap fra RoboMover.
- Pipet 10 ul ekstraksjon buffer (XB, PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus) i lokket av AdhesiveCap og inkuber den opp ned ved 42 ° C i 30 min.
- Spinner ned på 10.000 xg og sette lysatet på tørris. Lagre det ved -80 ° C inntil RNA ekstraksjon utføres.
- Gjenta 3.) Til 5.) Med alle andre deler.
6. RNA Utvinning
- Kombiner alle ti 10 ul lysates
- Fortsett med RNA isolering ved å arbeide ved romtemperatur i henhold til protokollen fra PicoPure RNA Isolation Kit, Arcturus, ved hjelp av et 1:1-forhold Extraction Buffer (XB) til 70% etanol (inkludert DNase Treatment).
7. RNA analyse
- Bruk en pl RNA for analyse av kvalitet og kvantitet ved hjelp av en Agilent 2100 Bioanalyser (PicoChip). Kvantitativ evaluering gjøres i referanse til en standard RNA loaded parallelt på brikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som vist i figur 1, ledet den modifiserte dehydrating protokoll til en forbedring av beta celler autofluorescens forhold til forrige publiserte protokoll 6. Påføring beskrevet protokoll, ble hver av 39 kirurgiske pankreatiske prøver brukt til å generere 40 serielle cryosections for et gjennomsnitt av 31'544'704 mikrometer 3 vev / bukspyttkjertelen prøven (område: 8'742'390 - 81'522'153 mikrometer 3) som vist i tabell 1. Dette representerer volumet av ca 18 pankreatiske øyer av 150 um diameter, eller av 35.000 β-celler. Vevet stammer fra et gjennomsnitt på 38 forskjellige holmer / bukspyttkjertelen prøven (område: 19-80 holmer), ble hver av dem vanligvis observert i to eller flere påfølgende seksjoner. Den store variasjon i utbyttet av holmer blant ulike prøver reflekterer heterogenitet av vevets kilde, enten bukspyttkjertelen hode eller hale, samt en progressiv forbedring av operatørene i detektereion av holmene innenfor 10 min tid viet til inspeksjon av hver seksjon.
Total RNA fra hver microdissected og lysert vev ble renset med Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit av Applied Biosystems og eluert i 11 ul, i henhold til protokollen fra produsenten. Ettertid 1 ul RNA for hver prøve ble analysert ved Agilent 2100 Bioanalyser. Vi oppnådd i gjennomsnitt 42 ng RNA / prøven (område: 5-229 ng / prøven) med en gjennomsnittlig RNA integritet nummer (RIN) på 5,8 (område: 3,4 til 7,2). Figur 2 viser et eksempel av RNA analyse. Uansett hvilken RIN verdien alle analyserte RNA prøvene ble med hell brukes til transcriptomic studier. Vi fant ikke en direkte sammenheng mellom mengden av microdissected vev og RNA yield. Forskjeller i tidsintervallet mellom høsting av kirurger og frysing av bukspyttkjertelen prøver etter sin undersøkelse og utgivelse av patologen kunne redegjøre i p kunst for variabel kvalitet og kvantitet av gjenvunne RNA. Andre viktige faktorer å vurdere er laser energi anvendt til microdissection, med lavere energi som gir den høyere RNA integritet, samt laser fokus og avstanden LPC poeng. Fokuset har en ideell beliggenhet ved en liten "effekt" av laseren på glasset på lysbildet, danner en liten svart prikk, kan bli sett. I våre hender de beste resultater oppnås med en laser energi 50%, en laser fokus av 65%, enskjønt tilpasset å kompensere for forskjeller i tykkelsen av seksjonene, og en avstand på LPC punkter av 5 mikrometer. Tillegg kan RNA kvantum bli optimalisert ved å holde arbeidshøyden av RoboMover, dvs. avstanden mellom limet hetten og seksjonen, så lavt som mulig for å unngå tap av microdissected vev under fange prosessen. I sett vår opp arbeidshøyden er på -10 100 vilkårlige PALM enheter.
| antall holmer / prøven | samlet vev volum / prøven [mikrometer 3] | RIN | konsentrasjon [ng / ul] | total RNA [ng] | |
| DP002 | 34 | 24'947'696 | 5.2 | 1.149 | 10.34 |
| DP003 | 30 | 41'141'488 | 5.5 | 1.677 | 15.09 |
| DP005 | 23 | 27'024'264 | 3.5 | 8.259 | 66.07 |
| DP006 | 25 | 45'900'848 | 3.4 | 7.399 | 59.19 |
| DP007 | <td> 3023'936'048 | 6.5 | 0.595 | 4,76 | |
| DP008 | 22 | 68'248'432 | 6.2 | 1.559 | 14.03 |
| DP010 | 34 | 33'156'752 | 5.6 | 1.750 | 19.25 |
| DP011 | 29 | 31'339'152 | 6.0 | 1.365 | 15.02 |
| DP012 | 34 | 57'594'360 | 6.3 | 3.025 | 33.28 |
| DP017 | 35 | 28'212'256 | 6.0 | 1.292 | 14.21 |
| DP030 | 35 | 48'007'530 | 5.6 | 2.180 | 23.98 |
| DP013 | 36 | 34'371'045 | 6.9 | 1.350 | 14.85 |
| DP014 | 35 | 21'360'060 | 7.2 | 1.270 | 13.97 |
| DP015 | 33 | 20'923'488 | 4.1 | 4.000 | 44.00 |
| DP019 | 40 | 35'431'704 | 7.0 | 1.670 | 18.37 |
| DP025 | 19 | 15'329'844 | 6.6 | 0.496 | 5,46 |
| DP034 | 19 | 81'522'153 | 6.4 | 4.260 | 46.86 |
| DP039 | 32 | 19'074'410 | 6.5 | 1.270 | 13.97 |
| DP040 | 44 | 31'565'630 | 5.4 | 2.300 | 25.30 |
| DP042 | 52 | 40'333'840 | 7.0 | 2.510 27.61 | |
| DP021 | 65 | 33'996'260 | 6.3 | 2.830 | 31.13 |
| DP023 | 19 | 19'513'310 | 5.6 | 8.250 | 90.75 |
| DP024 | 32 | 24'125'140 | 6.3 | 20.780 | 228,58 |
| DP038 | 23 | 18'306'040 | 6.6 | 11.700 | 128,70 |
| DP045 | 35 | 36'345'620 | 6.3 | 1.100 | 12.10 |
| DP033 | 42 | 26'078'550 | 6.5 | 15.380 | 169,18 |
| DP022 | 49 | 33'535'460 | 6.8 | 7.590 | 83.49 |
| DP041 | 56 | 34'899'830 | 5.7 | 3.350 | 36.85 |
| DP049 | 38 | 18'521'230 | 6.8 | 1.020 | 11.22 |
| DP028 | 32 | 16'410'670 | 5.6 | 1.720 | 18.92 |
| DP056 | 36 | 19'737'580 | 5.7 | 1.130 | 12.43 |
| DP059 | 52 | 23'376'180 | 3.6 | 7.880 | 86.68 |
| DP047 | 41 | 20'658'370 | 6.4 | 1.040 | 11.44 |
| DP036 | 23 | 8'742'390 | 3.5 | 0.950 | 10.45 |
| DP027 | 42 | 29'150'480 | 5.1 | 3.410 | 37.51 |
| DP046 | 54 | 16'800'070 | 5.3 | 8.210 | 90.31 |
| DP055 | 57 | 32'340'270 | 6.2 | 1.280 | 14.08 |
| DP064 | 74 | 41'896'460 | 6.5 | 2.440 | 26.84 |
| DP067 | 80 | 46'388'540 | 6.3 | 5.200 | 57.20 |
| gjennomsnittlig | 38 | 31'544'704 | 5.8 | 3.965 | 42.14 |
| antall holmer / prøven | samlet vev volum / prøven [mikrometer 3] | RIN | total RNA [ng] | ||
| rekkevidde | 19-80 | 8'742'390 - 81'522'153 | 03.04 til 07.02 | 4,76 til 228,58 | |
| gjennomsnittlig | 38 | 31'544'704 | 5.8 | 42.14 | |
Tabell 1. Oversikt over mengden av microdissected vev og kvaliteten og kvantiteten av de utpakkede RNA. Prøvene er i kronologisk rekkefølge. De innsamlede vevet blir beregnet slik: tykkelse cryosection (10 mikrometer) x microdissected området [mikrometer 2]. 1 pl RNA for hver prøve ble analysert på Agilent 2100 Bioanalyser PicoChip.
Figur 1. Egenverdi autofluorescens av menneskelige beta cellene autofluorescens av beta celler etter dehydrering av bukspyttkjertelen cryosections med reagenser som ble enten oppbevares i romtemperatur (A), eller iskald (B) (eksitasjon 450-490 nm, utslipp> 515 nm;. 400 x forstørrelse). Betacellene vises gult, mens bukspyttkjertelen kanaler, fartøy og kollagen vise en grønn farge. Målestokk: 75 mikrometer.
Figur 2. Kvalitet og kvantitet av ekstrahert holme RNA. Profil av en menneskelig holme RNA prøve erholdt med dette LMD protokollen (B) sammenlignet med en standard RNA prøven (A). 1 pl RNA for hver prøve ble påført på en PicoChip og analysert for quantity og kvalitet med Agilent 2100 Bioanalyser. (A): RIN (RNA integritet nummer) 7.7 [rRNA Ratio (28S/18S): 1,3)], (B): 7,2 RIN [rRNA Ratio (28S/18S): 1,1)]. Konsentrasjonen av øyen RNA var 1,3 ng / ul, for et samlet beløp på 10,3 ng fra 21'360'060 mikrometer 3 bukspyttkjertelen vev. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en pålitelig metode for laser mikrodisseksjon (LMD) av menneskelige holmer fra kirurgisk bukspyttkjertelen prøven. Forutsatt at en LMD mikroskop er tilgjengelig, kan denne prosedyren bli implementert i alle forskningsinstitusjon utfører delvis pancreatectomies, og dermed øke tilgangen til menneskelig holme materiale fra både ikke-diabetikere og type 2 diabetes pasienter. Dette er spesielt relevant gitt sparsommelige pancreata tilbys for holmen isolasjon. Gunstige aspekter LMD sammenlignet holme isolering ved kollagenase fordøyelse er redusert tid mellom Forklaring av vev og behandling av holmene for RNA 7 ekstraksjon, anriking av beta-celler 7, samt unngåelse av sterke mekaniske og enzymatisk manipulasjoner 8, 9,10, noe som kan endre genuttrykk profilen. I tilfelle av delvis pancreatectomized pasienter mer klinisk og metabolsk informasjon er vanligvis tilgjengelig enn i tilfelle av orgelgivere. På den annen side, isolering av holmer etter LMD gir kortere RNA med lavere RIN verdier sammenlignet med de som ble observert etter kollagenase fordøyelse og gir ikke levende holmer for funksjonelle studier. Videre kan bukspyttkjertelen sykdommen fører til kirurgi påvirke holmen ekspresjon. En avveining av disse fordeler og ulemper vil være oppnåelig gjennom komparative studier på et stort antall av holmen isoleringer utført av kollagenase fordøyelsen og LMD enten fra organdonorer eller delvis pancreatectomized pasienter, slik som de på-går i multisenter Innovativ Medisin Initiative for Diabetes (IMIDIA) med mål om "Bedre beta-celle funksjon og identifisering av diagnostiske biomarkører for behandling overvåking i Diabetes" ( http://www.imidia.org ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke alle våre kolleger som bidro med hjelp, råd og kritisk innspill i forskjellige trinn i dette prosjektet. Produksjon av denne videoen artikkelen ble støttet med midler fra IMIDIA ( http://www.imidia.org ), den tyske departementet for utdanning og forskning (BMBF) til den tyske senter for Diabetes Research (DZD, http://www.dzd -ev.de ) og Universitetssykehuset Carl Gustav Carus ved University of Technology Dresden. Arbeidet fører til denne publikasjonen har fått støtte fra Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking henhold tilskuddsavtalen n ° 155005 (IMIDIA), ressurser som er sammensatt av økonomiske bidrag fra EUs sjuende rammeprogram (FP7/2007-2013) og EFPIA selskapers tingsinnskudd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22x22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
- Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
- Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al.
- Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
- Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
- Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415 (2012).
