Vi beskriver anpassningen av optisk projektionstomografi (OPT)<sup> 1</sup> Till avbildning i det nära infraröda spektrumet, och genomförandet av ett antal beräkningsverktyg. Dessa protokoll möjliggör bedömningar av bukspottkörteln β-cellmassa (BCM) i större exemplar, ökar flerkanaliga kapacitet teknik och höja kvaliteten på passiv uppgifter.
Genom att anpassa OPT att inkludera förmågan att avbildning i det nära infraröda (NIR) spektrumet, visar vi här möjligheten att bilden större kroppar av pankreatisk vävnad, såsom råtta bukspottkörteln, och att öka antalet kanaler (celltyper) som kan studeras i ett enda prov. Vi beskriver vidare att genomföra ett antal beräkningsverktyg som ger: 1 / noggrann positionering av ett prov är (i vårt fall bukspottkörteln) masscentrum (KOM) vid rotationsaxeln (AR) 2, 2 / förbättrade algoritmer för tjänsten -justering tuning som förhindrar geometriska förvrängningar under tomografiska återuppbyggnaden 2 och 3 / ett protokoll för intensitet utjämning för att öka signal-brus-förhållanden i OPT-baserade BCM bestämningar 3. Dessutom beskriver vi en provhållare som minimerar risken för oavsiktliga rörelser provet under bilden förvärv. Tillsammans utgör dessa protokoll möjliggör bedömningar av BCM distribution och OTHER-funktioner, som skall utföras under volymen intakt pankreata eller andra organ (t.ex. i studier av ö-transplantation), med en upplösning ner till enskilda Langerhanska öarna.
De insulinproducerande β-cellerna är viktiga för kroppens förmåga att kontrollera homeostasen blodsockret. Därför bedömningar av bukspottskörteln BCM distributionen är viktigt att många områden preklinisk diabetesforskning. I utvärderingar av terapeutiska regimer till exempel effekterna av riktade gen ablation på endokrina celldifferentiering eller studier av diabetes etiologi i gnagarmodeller för sjukdomen beror ofta på sådana analyser. Traditionellt har dessa typer av bedömningar åberopas tidskrävande stereologisk metoder som är svåra att genomföra på grund av storleken och komplexa anatomiska konstitution i bukspottkörteln. De flesta högupplösta avbildning närvarande (vanligen optisk), ger inte tillräcklig penetrationsdjup för att hela bukspottkörteln avbildning hos gnagare. Omvänt, avbildning som inte begränsas av deras inträngningsdjup (typiskt kärnkraft) tillhandahålla dålig upplösning för att lösa hela BCM distribution och hämmasav bristen på tillräckliga kontrastmedel 4,5.
Optisk projektionstomografi är en 3D avbildning modalitet som möjliggör högupplösta bedömningar av biomedicinska prover på mm till cm skala 6. Härigenom kan information om den rumsliga position och volym individuella insulinbehovet uttrycker Langerhanska öar extraheras hela volymen av bukspottkörteln i normala och diabetiska möss 3,7-10. Syftet med denna studie är att ytterligare öka kapaciteten av denna teknik för bedömningen av bukspottkörtelns β-celler, deras endogena fördelning när ympade in i andra vävnader, deras förhållande till andra bukspottkörteln beståndsdelar (t.ex. infiltrera celltyper) och större pankreas förberedelser än tidigare.
Den infraröda optiska projektion tomografi (NIR-OPT) installation
I nedanstående protokoll, en OPT skanner baserad på den ursprungliga uppsättningen beskrivs av Sharpe <em> m fl 1, anpassad för avbildning i det nära infraröda området beskrives och används. För enkanaliga bedömningar av mus bukspottkörteln (t.ex. av BCM) kan SkyScan 3001 (Bioptonics) skanner användas.
En metallhalogenlampa som ger högre exciteringsenergi än en kvicksilverbåglampa vid våglängder över 650 nm, levererar excitationsljuset. Ljuset överförs genom en flytande ljusledare. En användbar kombination av fluorokromer och band filter passerar för NIR fluorescensavbildning och kanalseparation visas i figur 3. Det emitterade ljuset detekteras med en bakre upplyst CCD-kamera, med hög kvanteffektivitet i NIR-spektrat. OPT skanning automatiseras med hjälp av en LabView plattform som styr kameran och stegmotorn. För att stödja prov i storlek av intakt råtta pankreata, en skyddad silverbelagd spegel och en stor kyvett används. Äntligen en provhållaren som eliminerar oönskade vertikala movements av provet under avsökningen var utformad.
De beskrivna teknikerna för OPT avbildning möjliggör extraktion av rumsliga och kvantitativa parametrar genom hela volymen av den murina bukspottkörteln. På grund av begränsningar i möjlig lösning för denna typ av mesoskopisk avbildning bör det noteras att, som för de flesta avbildningsmetoder, desto större provet desto lägre upplösning (Även om användningen av en högre upplösning CCD bör öka upplösningen av OPT scan) . Därför, för bedömning av intakta lober bukspottkörteln mus, ger tekniken för närvarande inte en enda cell upplösning även om nära (ca 15-20 nm) 7. Fortfarande, för utvinning av BCM distribution i mus bukspottkörteln protokollen har lämnat uppgifter som mer än väl motsvarar de som erhålls genom t.ex. punkt räkna morfometri 3,13 Det bör noteras att även om genomförandet av CLAHE protokollet tillåter detektion av betydligt fler öar Dessa holmar är i allmänhet mindre och inte bidragte avsevärt till de totala β-cellvolymer.
De immunhistokemiska inblandade protokoll är relativt lång (upp till två veckor), men de faktiska händerna på tiden för provberedning är kort och därför tekniken lämpar sig väl för att studera stora grupper av djur 9. Om potential heterogena distributionsmönster är ett fokus för utredningen, bör det understrykas att försiktighet bör iakttas i stegen om fixering och montering för att undvika att pankreasvävnad blir fast i en ogynnsam sätt och en platt ("utspridda" ) montera av vävnaden bör eftersträvas för att underlätta sådana bedömningar.
En viktig fråga när du utför OPT är att provets COM fastställs till rotationsaxeln och att det inte rör sig, antingen vertikalt eller horisontellt, vid undersökningen. Därför är det viktigt att ha en stabil mekanisk installation och ett väl fungerande system för attaching provet. Vi löste problemet genom att bygga en ny montering (Figur 7).
Parallell geometri var inte sant för våra NIR-OPT eller Bioptonics 3001 scanner, som upptäcktes som en vertikal förskjutning mellan baksidan och framsidan positioner perifera föremål i inspelade projektionsbilder. Genom att justera objektet källan avstånd i loggfilen för respektive scannern (se 2.3.1) kan vi avsevärt förbättra kvaliteten på våra data och korrigera geometriska förvrängningar Längst kanter projektionsbilder, vilket är särskilt viktigt när bedöma större prover.
I det nuvarande protokollet, ger vi ett förslag på filter uppsättningar som möjliggör visualisering av tre olika specifika kanaler och en "anatomi" kanal i bedömningar av intakta pankreatiska preparat. Uppenbarligen dessa inställningar kan anpassas för att bättre passa fluorokromer som används för en given studie även om, som med alla former av fluorescerandeprocent mikroskopi bör den potentiella risken av signal genomblödning noggrant utvärderas. Studien av insulin märkta öar med fluorokromer som exciteras över 750 nm har ännu inte varit möjligt av oss med metallhalogen lampa som vår inrättats använder. Det är möjligt att en kamera med ännu högre kvantverkningsgrad i de relevanta våglängderna i kombination med alternativa ljuskällor (t.ex. diodlasrar) kan öka potentialen för NIR-OPT ytterligare och möjliggöra avbildning vid ännu högre våglängder.
OPT avbildning är en mycket mångsidig teknik för rumsliga och kvantitativa bedömningar av biomedicinska prov på mm-cm skala. Även om protokollen som presenteras här har utvecklats för det huvudsakliga syftet med bukspottkörteln / diabetesforskning de ska kunna översätta till forskning om andra arter, typer prov och markörer. Genom möjligheten att visualisera flera olika kanaler i intakta pankreatiska förberedelser NIR-OPT avbildning fTTERLIGARE har potential som ett verktyg för att utvärdera upptag specificiteten av kontrastmedel avsedda för icke-invasiva bedömningar av andra avbildningsmetoder, så länge dessa kontrastmedel kan vara utformade för att även en fluorofor upptäckas med OPT.
The authors have nothing to disclose.
Dr P. Lindström är känd för att ge ob / ob möss. J. Lehtonen är känd för hjälp med videoproduktion och J. Gilbert för hjälp med redigering. Denna studie har finansierats med bidrag från Diabetes Research Institute Foundation (AP), Juvenile Diabetes Research Foundation (AP och UA), Europeiska kommissionen (FP-7, bidragsavtal nr:. CP-IP 228.933-2) (JS och UA), Kempestiftelserna, Umeå universitet och den svenska Vetenskapsrådet till UA
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Methanol | Scharlau | ME03162500 | |
30% H2O2 | Scharlau | HI01362500 | |
Benzyl Alcohol | Scharlau | AL01611000 | |
Benzyl Benzoate | Scharlau | BE01851000 | |
Low-meltingpoint agarose | LONZA | 50100 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Mouse anti-aSMA-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Primary antibody |
Rabbit anti-CD3 | Sigma-Aldrich | C7930 | Primary antibody |
Guinea Pig anti-Ins | DAKO | A0564 | Primary antibody |
Donkey anti GP-IRDye680 | LI-COR Biosciences | 926-32421 | Secondary antibody |
Goat anti Rb-DyeLight750 | Thermo Scientific | 35570 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11076 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa488 | Molecular Probes | A-11008 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11012 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa680 | Molecular Probes | A-21076 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa750 | Molecular Probes | A-21039 | Secondary antibody |
OPT Skyscan 3001 | Bioptonics | OPT-Scanner | |
Leica MZ FLIII | Leica Microsystems | Stereomicroscope | |
Leica Objective 0.5x | Leica Microsystems | 10446157 | |
Leica Camera adapter 1.0x | Leica Microsystems | 10445930 | |
EL6000 Metal Halide | 11504115 | Lightsource | |
Liquid Light Guide | 11504116 | ||
Cuvette | Hellma Analytics | 6030-OG | 55 x 55 x 52.5 mm |
Mirror | Edmund Optics | F68-334 | 50 x 50 mm |
Andor Ikon-M | Andor Technology | DU934N-BV | Back-illuminated CCD |
Filterset | Chroma Technology | 41021-MZFLIII | TXR, Alexa-594, Cy3 |
Filterset | Chroma Technology | 41022-MZFLIII | IRDye680, Alexa-680 |
Filterset | Chroma Technology | 49037-MZFLIII | Dylight750, Alexa-750 |
ProteinG-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0618-01 | Protein G Sepharose 4 Fast Flow |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591 | Sodium azide 0.1 M solution |