새로운 도구는 HIV-1에 감염된 개인으로부터 규제 T 세포를 확장하려면
Summary
CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.
Abstract
CD4 + 조절 T 세포 (Tregs의)는 강력한 면역 변조기이며, 인간의 면역 항상성에 중요한 기능을 제공합니다. Tregs의 고갈은 암과 전염성 병원균에 대한 백신 설정에서 항원 특이 T 세포 반응의 측정이 증가하게되었다. 그들은 하나 해로운 HIV-1과 연관된 면역 활성을 억제하는 역할을하기 때문에 HIV-1 질병의 진행을 느리게하거나 또는 HIV-1 특이 면역을 억제함으로써 바이러스를 촉진 할 수 그러나, HIV-1 면역 기전에서의 역할은 논란이 남아있다 확산. 이해와 HIV-1의 맥락에서 변조 Treg 기능은 면역 또는 HIV 백신에 대한 잠재적 인 새로운 전략으로 이어질 수 있습니다. 그러나 중요한 질문을주의 깊게 연구 할 필요가 HIV-1 감염의 맥락에서 자신의 역할에 남아 있습니다.
Treg 인구 공부, 인간 CD4 + 말초 혈액에서 T 세포의 약 5 %를 대표하는 에스 어려운 것으로 입증되었습니다pecially HIV-1 관련 CD4의 T 세포 HIV-1에 감염된 사람들과 함께하는 Treg 고갈이 발생합니다. 고급 HIV-1 질병이나 조직 샘플은 단지 매우 작은 생물 학적 샘플을 얻을 수있는, 그러므로 매우 어려운과 개인의 규제 T 세포의 특성. 우리는 HIV-1 양성 개인의 Tregs의의 분리 및 확장을 사용하여 이러한 한계를 극복 할 수있는 기술적 인 해결책을 제안한다.
여기에서 우리는 성공적으로 체외에서 HIV-1에 감염된 개인으로부터 Tregs의 격리를 확장 할 수있는 쉽고 강력한 방법을 설명합니다. 흐름 분류 CD3 + CD4 + CD25 + CD127 낮은 Tregs의이 anti-CD3/anti-CD28 코팅 구슬로 자극하고 IL-2의 면전에서 배양 하였다. 확장 Tregs의이 FOXP3 높은 수준의 CTLA4를 표현 HELIOS 기존의 T 세포에 비해 매우 억압적인 것으로 보였다. Tregs의 큰 숫자에 쉽게 접근 연구자가 난을 해결하기 위해 수HIV-1 immunopathogenesis에서 자신의 역할에 관한 mportant 질문입니다. 우리는이 질문에 대답하는 것은 효과적인 HIV-1 백신의 개발에 유용한 통찰력을 제공 할 수 있습니다 믿습니다.
Introduction
HIV / AIDS 전세계 새롭게 2011 년에 감염 추정 2백50만명, 세계 에이즈 전염병을 억제하는 효과적인 HIV 백신에 대한 필요성과 함께 생활 이상의 3400 만 개인과 중요 남아 있습니다. 그러나 강렬한 연구 노력의 년간에도 불구하고, 현재까지 HIV-1 백신 효능 시험은 겸손 보호를 1-3로 이어질 및 보호 면역의 상관 관계를 제대로 이해 남아 있습니다. 보호에 필요한 면역 반응의 특성을 해명하는 것은 효과적인 HIV-1 백신과 HIV-1 감염을 대상으로 다른 immunotherapeutic 전략의 전략적 설계를위한 필수적입니다.
자연적인 CD4 + 조절 T 세포 (Tregs의)는 따라서 면역 – 매개 조직의 손상을 제한, 과도한 면역 활성을 조절하여 면역 세포의 항상성 유지에 중요하다. 그러나, 그들은 또한 병원균에 대한 면역 반응을 억제하고 자신의 통관을 방지 할 수 있습니다. 암과 헤파titis B 백신 연구는 Tregs의의 활동을 감소하는 백신 반응과 바이러스에 4-7에 대한 항원 특이 면역을 향상시킬 수 있음을 증명하고있다. 그러나 HIV-1 감염의 맥락에서, 규제 T 세포의 정확한 영향은 불완전하게 이해 남아있다. Tregs의이 활성화 된 T 세포 8 바이러스 복제를 감소 그리고 아마도 면역 활성화 9 영향을 표시했다. 그들은 또한 질병의 진행 10,11에 대한 부정적인 결과가있을 수 HIV-1 특이 면역 반응을 억제하기 위해 표시되었습니다. 따라서, HIV-1 백신의 효능을 강화하는 Treg 활동을 조절 할 수되기 전에,이 질병의 맥락에서 그들의 기능에 추가 통찰력을 얻을 것이 중요합니다.
인간 CD4 + 조절 T 세포는 약 5 CD4의 % + 말초 혈액에서 T 세포, 그리고 추가로 절대 숫자 HIV-관련 CD4 + T 세포 고갈 12와 감소를 나타내는 상대적으로 부족한 세포 인구입니다 </>을 먹다. 공동 문화를 Treg와 같은 T 세포 증식 분석으로 Treg 기능을 평가하는 현재의 분석은 비교적 큰 세포 수에게 12을 사용합니다. 따라서 진보와 개인에 규제 T 세포의 기능과 특이성을 특성화 HIV-1 질병은 HIV 병인에 대한 자신의 중요성에도 불구하고, 도전하고있다.
HIV-1 환자에서 Tregs의의 생체 분리 및 확장은 이러한 제한을 극복 할 수있는 솔루션을 나타낼 수 있습니다. 여기에서 우리는 체외에서 HIV-1에 감염된 사람에서 파생 된 기능 Tregs의 검색을 확장 할 수있는 쉽고 강력한 프로토콜을 설명합니다, 우리는 더 이상 어떻게 표현형을 해석하고 유세포 분석을 사용하여 억제 기능을 테스트합니다. 우리는이 프로토콜은 Tregs의 접근을 용이하게하고 HIV-1 질병의 진행에서 자신의 역할을 이해하는 데 도움이됩니다 믿습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Using the protocol described above, Tregs can be successfully isolated and expanded from HIV-1-infected individuals in vitro. Expanded Tregs express high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS, are highly suppressive and display a highly demethylated Treg-Specific Demethylation Region (TSDR) locus of the FOXP3 gene (data not shown) 15, suggesting true origin from the regulatory T cell lineage, as opposed to activation-induced transient FOXP3 upregulation. Deep sequencing demonstrated that the TCR repertoir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by research funding from the Elisabeth Glaser Pediatric AIDS Foundation (Pediatric HIV Vaccine Program Award MV-00-9-900-1429-0-00 to MMA), MGH/ECOR (Physician Scientist Development Award to MMA), NIH NIAID (KO8219 AI074405 and AI074405-03S1 to MMA), and the Harvard University Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI060354) which is supported by the following NIH Co-Funding and Participating Institutes and Centers: NIAID, NCI, NICHD, NHLBI, NIDA, NIMH, NIA, FIC, and OAR. These studies were furthermore supported by the Bill & Melinda Gates Foundation and the Terry and Susan Ragon Foundation.
Materials
| Reagents | |||
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | Stemcells technologies | 15062 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Histopaque | Sigma | H8889 | |
| Anti-CD3-PECy7 | BD Pharmingen | 557851 | |
| Anti-CD4-FITC | eBioscience | 11-0049-42 | |
| Anti-CD25-APC | eBioscience | 17-0259-42 | |
| Anti-CD127-PE | BD Pharmingen | 557938 | |
| Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh | BD Falcon | 352235 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-001-Cl | |
| Human Serum | Gemini Bio-Products | 100-512 | |
| Human T-activator CD3/CD28 | Life Technologies | 111.31D | |
| IL-2 | NIH Aids Research & Reference Reagent Program | 136 | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L34955 | |
| Anti-CD4-qdot-655 | Life Technologies | Q10007 | |
| Anti-CD25-PECy5 | eBiosciences | 15-0259-42 | |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBiosciences | 00-5523-00 | |
| Anti-FOXP3-PE | eBiosciences | 12-4776-42 | |
| Anti-HELIOS-FITC | Biolegend | 137204 | |
| Anti-CTLA4-APC | BD Pharmingen | 555855 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C34557 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Life Technologies | V12883 | |
| HEPES | Mediatech | 25-060-Cl | |
| Treg Suppression inspector | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Anti-CD4-APC | BD Pharmingen | 340443 | |
| Anti-CD8-AF700 | BD Pharmingen | 557945 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Glutamine | Mediatech | 25-002-Cl | |
| Materials | |||
| BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364606 | |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | – | |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | – | |
| FlowJo | Tree Star | v887 |
References
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