CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.
CD4 + regulatoriska T-celler (Tregs) är potenta immunmodulatorer och fyller en viktig funktion i människans immunsystem homeostas. Utarmning av tregs har lett till mätbara ökningar av antigenspecifika T-cellsvar i vaccin-inställningar för cancer och infektiösa patogener. Dock är deras roll i HIV-1 immuno-patogenes kontroversiell, eftersom de kan antingen användas för att undertrycka skadliga HIV-1-associerade immun aktivering och därmed bromsa HIV-1 sjukdomsprogression eller alternativt undertrycka HIV-1-specifik immunitet och därmed främja virus spridas. Förståelse och modulerande Treg funktion i samband med HIV-1 skulle kunna leda till potentiella nya strategier för immunterapi eller HIV-vacciner. Men viktiga öppna frågor kvar på deras roll i samband med HIV-1-infektion, som måste studeras noggrant.
Utgjorde ungefär 5% av humana CD4 + T-celler i perifert blod, studera Treg befolkningen har visat sig vara svårt, especially i HIV-1 infekterade individer där HIV-1-associerade CD4 T-cell och med att Treg utarmning inträffar. Karakteriseringen av reglerande T-celler hos individer med framskriden HIV-en sjukdom eller vävnadsprover, för vilka endast mycket små biologiska prover kan erhållas, är därför ytterst utmanande. Vi föreslår en teknisk lösning för att övervinna dessa begränsningar med hjälp av isolering och expansion av Tregs från HIV-1-positiva individer.
Här beskriver vi en enkel och robust metod för att framgångsrikt expandera Tregs isolerade från HIV-1-infekterade individer in vitro. Flow-sorterade CD3 + CD4 + CD25 + CD127 låg tregs stimulerades med anti-CD3/anti-CD28 belagda pärlor och odlades i närvaro av IL-2. Den expanderade tregs uttryckte höga nivåer av foxp3, CTLA4 och HELIOS jämfört med konventionella T-celler och visade sig vara mycket suppressiv. Enklare tillgång till ett stort antal Tregs låter forskare adress som jagmportant frågor om sin roll i HIV-1 immunpatogenes. Vi tror att svara på dessa frågor kan ge användbara insikter för utveckling av ett effektivt HIV-1-vaccin.
Med mer än 34 miljoner människor lever med hiv / aids i världen, och uppskattningsvis 2,5 miljoner människor som nyligen smittats under 2011, behovet av ett effektivt HIV-vaccin för att bromsa den globala HIV-epidemin är fortfarande av största vikt. Men trots tre decennier av intensiva forskningsinsatser, har HIV-1-vaccin effektivitetsstudierna hittills resulterat i endast blygsamma skydd 1-3 och korrelat av skyddande immunitet Oklara. Belysa karaktären av immunsvaret som behövs för skydd är nödvändigt för den strategiska utformningen av ett effektivt HIV-1-vaccin och andra immunterapeutiska strategier för hiv-1-infektion.
Naturliga CD4 + regulatoriska T-celler (Tregs) är kritiska för upprätthållande av immunceller homeostas genom att kontrollera överdriven immunaktivering och därmed begränsa immunmedierad vävnadsskada. Men de kan undertrycka även immunsvar mot patogener och förhindra deras avslut. Cancer och Hepatitis B-vaccin studier har visat att minska aktiviteten hos Tregs kan förbättra vaccin respons och antigen-specifik immunitet mot virus 4-7. Men i samband med HIV-1-infektion, är den exakta effekten av reglerande T-celler ofullständigt förstådd. Tregs visades minska virusreplikation i aktiverade T-celler 8 och eventuellt påverka immun aktivering 9. De har också visat sig hämma HIV-1-specifika immunsvar, vilket kan få negativa utfall för sjukdomsprogression 10,11. Således, innan de kan modulera Treg aktiviteten för att öka effekten av en HIV-1-vaccin, är det viktigt att få ökad insikt i deras funktion i denna sjukdom sammanhang.
Human CD4 + regulatoriska T-celler är en relativt begränsad cellpopulation, vilket motsvarar omkring 5% av CD4 +-T-celler i perifert blod, och deras absoluta tal ytterligare minskning med HIV-associerade CD4 + T-cell depletion 12 </ Sup>. Nuvarande analyser för att bedöma Treg funktion, såsom T-cellproliferationsanalyser med Treg samodling, använder relativt stora cellantal 12. Därför kännetecknande funktion och specificitet av reglerande T-celler hos personer med avancerad HIV-1 sjukdom har varit en utmaning, trots deras betydelse för HIV patogenes.
Den ex vivo isolering och expansion av Tregs från HIV-1-patienter skulle kunna utgöra en lösning för att övervinna några av dessa begränsningar. Här beskriver vi en enkel och robust protokoll för att expandera funktionell Tregs härlett från HIV-1 infekterade individer in vitro; vi ytterligare förklara hur fenotyp dem och testa deras undertryckande funktion med flödescytometriska analyser. Vi tror att detta protokoll kommer att underlätta tillgången till Tregs och hjälp att förstå sin roll i HIV-1 sjukdomsprogression.
Using the protocol described above, Tregs can be successfully isolated and expanded from HIV-1-infected individuals in vitro. Expanded Tregs express high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS, are highly suppressive and display a highly demethylated Treg-Specific Demethylation Region (TSDR) locus of the FOXP3 gene (data not shown) 15, suggesting true origin from the regulatory T cell lineage, as opposed to activation-induced transient FOXP3 upregulation. Deep sequencing demonstrated that the TCR repertoir…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by research funding from the Elisabeth Glaser Pediatric AIDS Foundation (Pediatric HIV Vaccine Program Award MV-00-9-900-1429-0-00 to MMA), MGH/ECOR (Physician Scientist Development Award to MMA), NIH NIAID (KO8219 AI074405 and AI074405-03S1 to MMA), and the Harvard University Center for AIDS Research (CFAR), an NIH funded program (P30 AI060354) which is supported by the following NIH Co-Funding and Participating Institutes and Centers: NIAID, NCI, NICHD, NHLBI, NIDA, NIMH, NIA, FIC, and OAR. These studies were furthermore supported by the Bill & Melinda Gates Foundation and the Terry and Susan Ragon Foundation.
Reagents | |||
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | Stemcells technologies | 15062 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
FBS | Sigma | F4135 | |
Histopaque | Sigma | H8889 | |
Anti-CD3-PECy7 | BD Pharmingen | 557851 | |
Anti-CD4-FITC | eBioscience | 11-0049-42 | |
Anti-CD25-APC | eBioscience | 17-0259-42 | |
Anti-CD127-PE | BD Pharmingen | 557938 | |
Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh | BD Falcon | 352235 | |
X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-001-Cl | |
Human Serum | Gemini Bio-Products | 100-512 | |
Human T-activator CD3/CD28 | Life Technologies | 111.31D | |
IL-2 | NIH Aids Research & Reference Reagent Program | 136 | |
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L34955 | |
Anti-CD4-qdot-655 | Life Technologies | Q10007 | |
Anti-CD25-PECy5 | eBiosciences | 15-0259-42 | |
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBiosciences | 00-5523-00 | |
Anti-FOXP3-PE | eBiosciences | 12-4776-42 | |
Anti-HELIOS-FITC | Biolegend | 137204 | |
Anti-CTLA4-APC | BD Pharmingen | 555855 | |
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C34557 | |
Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Life Technologies | V12883 | |
HEPES | Mediatech | 25-060-Cl | |
Treg Suppression inspector | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
Anti-CD4-APC | BD Pharmingen | 340443 | |
Anti-CD8-AF700 | BD Pharmingen | 557945 | |
RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
Glutamine | Mediatech | 25-002-Cl | |
Materials | |||
BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364606 | |
FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | – | |
LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | – | |
FlowJo | Tree Star | v887 |