Telomerlængde og telomerase-aktivitet, A Yin og Yang celleældning

Summary

En nøjagtig, korte, sofistikeret og billig metode er beskrevet, der vurderer telomer længde i flere væv og arter ved hjælp qRT-PCR. Derudover vil vi beskrive en enkel assay at vurdere telomerase-aktivitet som en supplerende rygrad test for telomer længde.

Abstract

Telomerer gentager DNA-sekvenser på spidsen ender af kromosomer, der er forskellige i længden og i mennesker kan nå en længde på 15.000 basepar. Telomer tjener som en biobeskyttende mekanisme af kromosom nedslidning ved hver celledeling. På en vis længde, bliver telomerer for kort til at tillade replikation, en proces, der kan føre til kromosom ustabilitet eller celledød. Telomerlængde reguleres af to modsatrettede mekanismer: nedslidning og forlængelse. Nedslidning optræder som hver celle deler. I modsætning hertil er forlængelse delvis moduleret af enzymet telomerase, som tilføjer gentagne sekvenser til enderne af kromosomer. På denne måde kunne telomerase muligvis vende en aldrende mekanisme og forynger celle levedygtighed. Det er afgørende elementer i at opretholde celle liv og anvendes til at vurdere cellulær aldring. I dette manuskript vil vi beskrive en præcis, kort, sofistikeret og billig metode til at vurdere telomer længde i multiple vævs og arter. Denne metode drager fordel af to hovedelementer, tandemgentagelsesregionen af ​​telomer sekvens og følsomheden af ​​QRT-PCR til påvisning af differentierede kopiantal af testede prøver. Derudover vil vi beskrive en enkel assay at vurdere telomerase-aktivitet som en supplerende rygrad test for telomer længde.

Introduction

Telomerer gentager DNA hexamersekvenser (TTAGGG) sekvenser fundet i enderne af kromosomer. I hver celle replikation, er disse kromosom ender forkortes. Hvis de bliver for kort, kan kromosomer undergå telomer ende fusioner, afvigende rekombination, og nedbrydning. Derfor tilstrækkeligt telomer længde vedligeholdelse spiller en stor rolle i kromosom stabilitet og cellebeskyttelse ^38.. Telomerlængde vedligeholdelse er også afgørende for gener, der findes nær enderne af kromosomer, da DNA-replikation ikke kan fortsætte til den bitre ende af kromosomerne ^1-2. Derfor kan forebyggelse af telomer afkortning forbedre celle stabilitet.

Talrige undersøgelser har rapporteret, at telomer længde er korreleret med en organismes levetid og sygdomstilstand, såsom cancer ^3-4, diabetes ^5, og hjertekarsygdomme ^6,7. Derudover har forkortede telomerer blevet forbundet med overdreven stress eller enusund livsstil ^8, måske ved at fremme tidlig celle aldring og død ^9.. På den anden side har nogle undersøgelser vist, at der ikke er signifikant forskel mellem telomer længde og levealder og aldersrelaterede sygdomme ^{39, 40, 41.}

En af cellens medfødte mekanismer for beskyttelse fra telomer afkortning er ved at aktivere sin egen enzym telomerase revers transkriptase (TERT). Dette enzym og dets underenhed, telomerase RNA (TERC), en ikke-kodende RNA, bruge telomer som en skabelon til at tilføje telomer gentagelser til kromosom ender ^10. Selvom telomerase-aktivitet er fraværende fra flere typer af celler og andre mekanismer er involveret i telomerlængde vedligeholdelse, er øget telomerase-aktivitet korreleret med øget telomer længde. Telomerase aktivering, er blevet etableret som en af ​​de mekanismer, som cellerne reagerer på skader og stress og undgå for tidlig ældning og død. For eksempel, te længerelomeres blev påvist i en population af Ashkenazi jøder med exceptionel levetid ^11, har mutationer i TERC eller TERT vist sig at bidrage til dødelig sygdom ^12, og epigenetisk regulering af telomerase har vist sig at have en virkning på aldersrelaterede sygdomme ^13.. Siden opdagelsen har telomerlængde blevet foreslået som en biomarkør for sundhedstilstanden i forskellige dyremodeller samt hos mennesker, men disse tidlige undersøgelser var vanskelige at bredt replikere fordi den anvendte metode var kedelig, lang og dyr. I 2002 og yderligere tunet i 2009, foreslog cawthon og viste en ny, præcis, hurtig og enkel PCR-protokol til at vurdere telomerlængde og yderligere at undersøge sin rolle i forskellige aspekter af cellebiologi, aldring og sygdom ^19..

At vælge den rigtige telomer målemetode for en undersøgelse er afgørende. I øjeblikket er der forskellige metoder, der anvendes til at måle telomer længde, hver med sin egenfordele og ulemper. Traditionelt er telomer længde måles ved hjælp af Southern blot-analyse af terminale restriktionsfragmenter (TRFs), som omfatter: en. fordøjelse af DNA'et med restriktionsenzymer, der ikke skåret i telomer gentagelser for at opnå TRFs, b.. Southern Blot af disse TRFs sker ved at bestemme den gennemsnitlige TRF længde ved hjælp af en telomeriske sonde ^{14., 37..} Selv om denne metode er meget præcis med en lille variationskoefficient, er et direkte mål, og kan være fordelagtige til at måle længden fordeling, TRF analyse er kostbar, arbejdskrævende og kræver mindst 3 ug DNA. Denne metode er også ufølsom over for korte telomerer og længde bestemmelse kan forveksles med subtelomeric DNA, som kan detekteres af føleren på grund af (TTAGGG) n lignende sekvenser, de indeholder ^{15, 42,.}

En anden meget præcis metode til måling telomerlængde er Single Telomere Forlængelse Længde Analysis (STELA), et single molekyle PCR-metode, der kun kræver en lille mængde DNA. I denne metode, er primere til genkende G-rige overhæng ved slutningen af ​​kromosomer og til at binde til en unik subtelomeric sekvens på et kromosom, der forstærker telomer af en specifik kromosom. Den resulterende forstærkning er derefter visualiseret ved Southern Blot. Denne metode har den fordel af at være meget præcis og er i stand til at detektere korte outlier telomerer ^16. Desværre, da ikke alle kromosomer har G-rige ender og en brugbar subtelomeric sekvens kan telomerlængde kun måles på specifikke kromosomer og disse målinger kan ikke repræsentere længden af alle telomerer i cellen ^15..

En anden metode, der har været praktiseret, er brugen af ​​peptid nukleinsyre (PNA)-prober til påvisning af telomer længde. Kvantitative Florescence in situ hybridisering (Q-FISH) giver os mulighed for at visualisere telomerer under metafase, hvor staining af telomerer med en PNA-probe i forhold til deres størrelse tillader sammenligning af telomerer mellem specifikke kromosomer. Selv om denne metode kan også anvendes til celler i interfase, her telomer længde til forskellige kromosomer kan ikke påvises, hvilket indfører en begrænsning ved måling telomer længde i ældede eller sjældent delende celler ^17. Flow FISK stedet bruger flowcytometri og er i øjeblikket den mest følsom metode til måling af telomer længde af blodceller i kliniske omgivelser, men kræver højt kvalificerede teknikere ^18..

I øjeblikket er den standardmetode til måling af gennemsnitlig telomer længde i vores laboratorium drager fordel af præcision, følsomhed og nem kvantitativ real-time PCR. Denne metode blev gjort muligt for måling telomer længde ved udvikling af nye primere, der undgår syntesen af ​​primer-dimer-afledte produkter, som ellers ville være blevet produceret i somtandard assay på grund af den gentagne karakter af telomerer. Til dette assay, er målingen af ​​telomer længde repræsenteret ved T / S forhold, telomer repeat kopitallet til enkelt-kopigen nummer. Da der er en direkte proportionelt forhold mellem telomer længde og antallet af mærkede telomer primere binder til DNA i begyndelsen stadier af PCR, T / S-forholdet er direkte proportional med telomer længde. T / S forhold måles ved at sammenligne forskellen i Ct, fraktioneret cyklus nummer hvor prøven akkumulerede fluorescens krydser en tærskelværdi, der er flere standardafvigelser over baseline fluorescens, mellem prøverne med telomer primere og SCG primere ^19.. Denne metode er blevet kritiseret for sin indirekte måling af telomer længde, hvilket kan føre til unøjagtige målinger, for eksempel i tilfælde af kromosom overlapninger eller kopital variationer ^15. Også sammenligning mellem undersøgelser er ofte difficult, men standard oligomerer er blevet udviklet til at måle absolut telomer længde ^20. Denne metode blev fremmet forbedret ved cawthon, ved hjælp af en monokrom multiplex qPCR assay. I dette assay blev PCR kørt ved lavere temperaturer i de første par cyklusser for at undgå primer-dimer bindende og telomer og kontrol-genet blev analyseret i den samme PCR-rør til yderligere at undgå fejl. De resulterende telomer længde målinger stærkt korreleret med telomer længde målt ved Southern blot-analyse af TRFs og havde højere nøjagtighed ^{15, 19, 36.} I øjeblikket er QRT-PCR er den eneste praktisk metode til rådighed for afprøvning store prøvestørrelser og kræver kun en lille mængde af DNA til at udføre. En afgørende del af denne metode er omfattende kvalitetskontrol, så når det er gjort ordentligt, kan denne metode give værdifulde sammenlignelige oplysninger om telomerlængde. Derudover var denne metode blevet tilpasset til brug over leukocytter til målingtelomer længde i en række forskellige væv ^42.

Derudover, for yderligere at forstå biologien bag telomer længde vedligeholdelse og interaktioner mellem de to modsatrettede virkninger (dvs. telomer afkortning under replikation og forlængelse af telomerase enzymet), ledsaget vi telomer længde metoden med et ekstra forsøg, der måler telomeraseaktivitet.

Til dette formål anvendte vi en telomeriske Gentag Amplifikationsprotokol, et in vitro-assay. Kort fortalt lyseret, konserveret, enzymatisk aktive celler syntetiseret telomere gentagelser på et oligonukleotid underlaget med telomerase, og produkterne blev amplificeret under anvendelse af PCR i nærværelse af SYBR Green. Resultaterne blev derefter analyseret ved at sammenligne prøve og kontrol-Ct-tærskelværdier. Da telomerase er et varmefølsomt enzym, en yderligere varmebehandlet kontrol køres sideløbende hver prøve ^21.

<p class="Jove_content"> Mens måling telomerlængde kan give værdifuld indsigt i den mulige rolle telomer længde i patofysiologien for aldring og sygdom, telomerlængde er ikke en statisk egenskab og mere information er nødvendig for at forstå telomer funktion. Telomerase-aktivitet undersøgelser kan tilføje oplysninger om telomerlængde reguleringsmekanismer. For eksempel kan den styrede aktivering af telomerase opretholde telomer længde og celleproliferation, men ukontrolleret aktivering af telomerase kan resultere i cancer. Disse to billige og ligetil kombineret metoder givet os ikke kun med stærkere beviser mod en relation mellem telomerlængde og cell stabilitet, men også yderligere indblik i de mulige mekanismer telomer afkortning og nyttiggørelse. Med disse metoder, vi håber at yderligere at belyse cellens reaktion på aldring og forskellige stater i celledelingen med det ultimative mål for en bedre forståelse af det centrale mechanisms cellebiologi.

Protocol

1.. Telomerlængde Protokol 19 DNA-isolering De fleste DNA-isolering metoder kan anvendes. Vores Lab foretrækker Qiagen DNeasy Kit (# 69.506) for blod kilder. Afhængigt af kilden til DNA, såsom buccale eller andre kilder, kan en anden isolation metode. Primere: Alle primere er fortyndet til en stamkoncentration på 100pmoles/μl i PCR-kvalitet vand og opbevaret ved -20 ° C, indtil der. Working lagre af …

Representative Results

Et eksempel på en telomer længde QRT-PCR analyse er vist i figur 1.. Øverst til venstre panel, repræsenterer prøverne mærket i rødt og grønt placeringen af ​​de testede emner på 96-brønds plade. Øverst til højre panel, er forstærkning kurve demonstreret. Hvert individ testes ved to assays (Telomer og Single Copy Gene), hvilket sker i triplikater. På grund af forskellige DNA-kopier fremstillet i de to analyser af udvalgte personer, antallet af cykler indtil fluorescens detektion når si…

Discussion

Telomer længde giver en unik cellulær markør for at studere den stressede og aldrende celle og giver indsigt i mekanismerne af aldring. Siden sin rolle i aldring først var blevet foreslået, har et væld af undersøgelser er blevet udført vedrørende telomerlængde alder, levetid, aldersrelaterede sygdomme, kræft og stress. I årtier var guldstandarden telomerlængde målinger terminal restriktionsfragmentanalyse hjælp Southern hybridisering. Men for nylig en overkommelig, hurtig og let at udføre metode cawthon …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Quantitative Telomerase Detection	Allied Biotech	MT3012
Qiagen DNeasy Kit	Qiagen	69506
LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument	Roche Diagnostics	4707516