Biz geliştirdi ve düşük maliyet için hazır parçalardan inşa minyatür chemostats küçük bir yer kaplayan dizi doğrulanmış. Fizyolojik ve deneysel evrim sonuçları büyük hacimli chemostats benzerdi. Ministat dizi geleneksel kemostat deneyler, fonksiyonel genomik ve kimyasal tarama uygulamaları için, kompakt, ucuz ve erişilebilir bir platform sağlar.
Chemostats hücreler kültür yoğunluğu belirli besinlerin sınırlandırılması ile kısıtlı bir sıkı kontrol, kimyasal sabit ortamda yetiştirilen olduğu sürekli kültür sistemleri vardır. Chemostats gelen 1,2 Veri onlar sabit bir büyüme hızı sağlamak gibi nicel fenotiplerinin ölçümü için son derece tekrarlanabilir Kararlı durumda ve çevre. Chemostats Bu sebeplerden dolayı, chemostats gen ekspresyonu 3-6 ve kararlı durum denge kültürlerin diğer özelliklerinin analizi yoluyla fizyolojisi ince ölçekli karakterizasyonu için yararlı araçlar haline gelmiştir. 7 Uzun süreli deneylerde mikrobiyal populasyonların benimsemesini belirli yörüngeleri vurgulayabilirsiniz kontrollü bir ortamda uyumsal evrimi sırasında. Aslında, chemostats onların icadından beri deneysel evrim için kullanılmaktadır. 8 evrim deneyleri yaygın bir sonuç her biyolojik çoğaltmak için mutasyonlar eşsiz bir repertuar elde etmek. 9-13 Bu çeşitlilik çok çok daha büyük throughput ile evrim deneyleri gerçekleştirerek orada keşfedilmeyi kaldığını göstermektedir.
Biz burada minyatür chemostats-veya nispeten basit, düşük maliyetli dizi tasarımı ve işletimi sunmak ministats-ve fizyoloji belirlenmesinde ve maya ile evrim deneylerde kullanımlarına doğrulamak. Bu yaklaşım chemostats onlarca peristaltik pompa çoğaltılmış tek bir kaçıp büyümesini gerektirir. Kültürler çeşitli uygulamalar için kullanışlı olan bir 20 ml'lik bir çalışma hacmi, tutulur. Bu, üretilen artan giderleri azalmakta ve detaylı bina ve çalıştırma talimatlarını veren de işlevsel suşları, türler, ve büyüme parametrelerini çok sayıda karakterize yanı sıra genetik için genel bir platform olarak bu tasarım araştırma ve endüstriyel uygulama motive edebilir umut ediyoruz veya uyuşturucu kütüphaneler.
Mikrobiyal büyüme ve evrim dinamiği mikrobiyoloji, ekoloji, genetik ve biyoteknoloji için gereklidir. Kültür mikropların en yaygın yöntem hücrelerin besin açısından zengin suyu içine düşük yoğunluklu inoküle ve doygunluğunu yetiştirilen toplu, içinde. Standart laboratuar ekipmanları kullanarak gerçekleştirmek için basit olsa da, toplu kültürleri dalgalı bir kimyasal ortamda yaşamaya ve buna hücresel fizyoloji değişiyor. Bu heterojen büyüme ortamı ince fizyolojik farklılıklar maskeleyebilir ikincil büyüme ve stres etkilere neden olabilir. Seri toplu transferi Deneysel evrim belirli seçici koşullarına uyarlamaları bağlanmaya çalışırsa, komplike, büyüme fazına özel alt popülasyonlarının kompleks karışımlar için seçebilirsiniz. Kantitatif fenotipleri ölçümü gibi gecikme süresi gibi özellikleri kesin örnek zamanlama ve varyasyon gelen gürültü nedeniyle zor olabilir. Sürekli kültürlerin bir alternatif sağlamakbüyüme rejimi nereye hücreleri tekrarlanabilir fizyolojik bir kararlı duruma ulaşmak için tanımlanmış bir büyüme oranı bir kimyasal homojen bir ortamda yetiştirilebilir. Bu avantajları nedeniyle, hücresel devlet deneysel evrim ve karakterizasyon çalışmaları genellikle kemostat gibi sürekli kültürlerin kontrollü bir ortamda kullanmaktadır. 14.
Bu avantajlardan Takdir kemostat kültürlerde ilgi bir canlanma yol açmıştır. 15 1950 yılındaki çıkışlarından bu yana, 1,2 kemostat sistemleri litreden mikrolitre değişen ölçeklerde çeşitli ve çeşitli uygulamalar için fonksiyon geliştirilmiştir. 16. Ticari olarak üretilen biyoreaktörler gelen özel mikroakışkanları platformlara glassblown gemilerin payı genel tasarım ilkeleri arasındadır -19 Bunlar çeşitli tasarımlar,. Bir kültür odası karıştırıldı havalanmış ve (genellikle hava yoluyla köpüren tarafından) ve burada yer alan mikroplar homojen tutulur edilirly her zaman kültür odası boyunca dağınık. Tanımlanan bileşimin sürekli olarak taze ortam ilave edildi ve ilave bir büyüme oranını kontrol eden ve kültür tarafından tecrübe kimyasal çevre etkiler. Bir taşma büyüme tüp içinde kültür hacim belirler ve bu taşma yoluyla kültür, taze ortam girdiği de aynı hızda numuneler alınacaktır. Bu şekilde kültürler hızla birçok biyolojik parametreler sabit kalır hangi bir fizyolojik kararlı bir duruma ulaşması. Chemostats ve literatürde bu çeşitli platformlarda raporlar avantajlara rağmen, yaygınlaşmasının bu sistemleri kurma ve işletme zorlukları ve ticari seçenekler getirdiği yüksek maliyetleri ile sınırlı kalmıştır. Ayrıca bu cihazlar yapmak ve nasıl kullanılacağını açıklamaları opak olabilir.
Biz tasarımları ve düşük maliyetle hazır parçalardan inşa minyatür chemostats küçük bir yer kaplayan dizinin kullanım talimatlarını sunuyoruz. Biz atılbüyük hacimli ticari biyoreaktörlerde kültüre maya için bildirilen verilere bizim cihaz karşılaştırırken oldukça tutarlı deneysel parametreleri ve tekrarlanabilir sonuçlar Erve. Bu 10-15 nesiller içinde kararlı durum dengeye ulaşması ve denge benzeri kültür yoğunlukları elde aracılığıyla görüldüğü gibi hücresel fizyoloji tekrarlanabilirliği içerir. Ayrıca, gen ekspresyonu ministats ve bir ticari daha büyük hacimli bir platform ile tutarlı. Üç tekerrürlü kültürleri arasında seyreltme oranı, optik yoğunluk ve gen ekspresyon tekrarlanabilirliği kararlılığı bizim platformu sağlamlığını göstermek. Biz de aynı adaptif mutasyonların büyük hacimli chemostats ile benzer deneysel evrim zaman ölçeğinde ortaya olduğunu göstermektedir.
Herhangi kemostat olduğu gibi ministats içinde kemostat ekimi, ayrıntı ve sorun giderme dikkat gerektirir. Kontaminasyon sürekli kültür deneylerinde büyük bir endişe olduğu için, biz genellikle bakteri ve mantar aşılama sırasında kirlenme ve uzun vadeli evrim deneyleri sırasında her 50 nesiller için mikroskop üzerinden bakmak. Biz 300'den yüksek nesiller (veriler gösterilmemiştir) 96 evrim deneyi üzerinde kontaminasyon tespit değil bugüne kadar. Ministats ve atık su hattı yoluyla kültür odası kolonize mikropların potansiyeli arasındaki çapraz kirlenme için test etmek için, her bir diğer ministat yukarıdaki gibi maya ve geri kalan herhangi bir kültürü ile inoküle değil ile inoküle edildiği gibi 16 ministats bitti. Kültürleri her gün boşaltılmış bir ortak atık kabına örneklenmiştir. Kirletici atık çizgisi üzerinden girmek için mümkün olsaydı Böylece biz büyük olasılıkla gözlenen olurdu bu experim içindeent. Üç hafta ve biz sigara inoküle ministat kültür tüpleri büyüme gözlemlemek vermedi inoküle ve non-inoküle kültürlerin bu dama tahtası deseni büyüme 100'den büyük nesiller dışında maya ya da diğer mikroplar kontaminasyon deneylerinde olasl düşündüren sırasında benzer zaman dilimlerini.
Ministats ticari chemostats benzer bir moda çalışmak üzere tasarlanmış olmasına rağmen, bu düzenlemenin modüler yapısı optimizasyonu için kullanıcıların ihtiyaçlarına ve bütçelerine uygun sağlar. Bu protokolde kullanılan peristaltik pompa 0.0186 vol / saat 3.6 hacim / saat (veriler gösterilmemiştir) arasındaki akış hızlarına ulaşabilirsiniz. Seyreltme oranları artmış kontrolü alternatif pompa modelleri ile elde edilebilir. Düşük seyreltme oranlarda işlem damlacık teslim aynı frekansı elde etmek için daha yüksek bir iğne arasında ikame gerektirebilir. Nüfus büyüklüğü evrim deneyleri uygun tasarımı için önemli bir husustur.Burada kullanılan standart dilüsyon oranı ve besin konsantrasyonu yayınlanan evrim çalışmaları olarak büyüklükte aynı düzenin nispeten büyük bir nüfus büyüklüğü (~ 10 9 hücreleri) içerir. 11. Büyük veya küçük kitlelerin çalışma hacmini değiştirerek veya besin konsantrasyonu sınırlayarak muhafaza edilebilir. Artan mutasyon kaynağı da yüksek mutasyon oranlarına sahip suşlar ile çalışarak elde edilebilir.
Ministats da mevcut tasarımı üzerinde geliştirilebilir. Örneğin yoğuşma kültürü tüp duvarları üzerinde toplamak ve büyük derin su banyosunda, inkübatör veya sabit sıcaklık odasında kullanılarak azaltılabilir için. Topaklanma ve sülfat sınırlı kültürlerde duvar büyüme 300 nesiller (veriler gösterilmemiştir), yüzey çeşitli 5/48 evrim deneylerde ortaya çıkan, nispeten nadir görülür rağmen bu özelliği azalan veya geciktirmek yardımcı olabilir mevcuttur. Topaklanma uygun kültür müdahale durumundaKarışım, yüksek ajitasyon her bir hava pompası ayrılır yolu sayısını azaltarak ya da bir karıştırma aparatı ekleyerek elde edilebilir. Çözünmüş gaz konsantrasyonu, pH, ya da diğer parametreler için ek probları, aynı zamanda, bazı başka tasarımlarda olduğu gibi, dahil edilebilir. 17
Büyük hacimli ticari chemostats için bildirilen verilere bizim cihaz karşılaştırırken potansiyel değişim rağmen, bu protokolde belirtilen ministats kullanarak, biz son derece tutarlı deneysel parametreleri ve tekrarlanabilir sonuçlar gözlenmiştir. Bu 10-15 nesiller (Şekil 2A) içinde kararlı durum dengeye ulaşması ve denge benzeri kültür yoğunlukları elde aracılığıyla görüldüğü gibi hücresel fizyoloji tekrarlanabilirlik dahil. Gen ekspresyonu demir metabolizması genetik dışında, biyolojik üç ministats çoğaltır genelinde ve ministats ve ticari büyük hacimli platformlar (Şekil 2B) arasında tutarlıydı. Bu expdışarı yansıması farklılıklar muhtemelen iki aygıt veya medya maddeler kalitesinde iyileştirmeler metal içeriği değişikliklerden kaynaklanır. Bizim veri ministats tutarlı bir ortam gereklidir fizyoloji veya rekabet deneyler için yararlı olacağını düşündürmektedir.
Ministat tasarımı biz 250 nesiller için sülfat sınırlaması altında kültürler gelişti ve SUL1 loküsündeki amplifikasyon karakterize etmek CGH kullanılan deneysel evrim uygulamalar için yeterli olup olmadığını test etmek için -. Daha büyük hacimli chemostats bu koşullar altında uzun-dönemli evrimi bir işaretidir 10 Biz gözlenen sülfat sınırlı medya 4/4 bağımsız bir evrim deneyleri (Şekil 2C) adlı klonlar SUL1 amplifikasyonu. Bir bütün olarak ele alındığında bu veriler, ministats geleneksel kemostat çeşitli uygulamalar için yararlı olabilecek güçlü bir platform olduğunu göstermektedir. Biz kültür tomurcuklanan maya kullanımı gözlenmekle birlikte, ministats gerekirAyrıca aslında kültür bakterileri ve diğer maya türleri için kullanılmış diğer organizmalar ve benzer tasarımları ile uyumlu olması. 16,17,25 Dahası küçük kültür düzeyi ve medya için korelasyon azalmıştır ihtiyaç gerektiren deneyler için ministats cazip bir alternatif hale getirebilir pahalı ve egzotik reaktifler olarak kimyasal ya da genetik ekranlarında söz konusu olabilir.
The authors have nothing to disclose.
Video Yaratılış Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi (5P41RR011823-17) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Genel Sağlık Bilimleri Ulusal Enstitüsü (8 P41 GM103533-17) hibe tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda NSF hibe 1120425 tarafından desteklenmiştir. MJD Bir Rita Allen Vakfı Akademik olduğunu. AWM NIH T32 HG00035 tarafından kısmen desteklenmektedir. Biz protokolleri geliştirmek için yardım Anna Sunshine ederim. Ayrıca, ministats erken kullanıcıları olarak Sara DiRienzi, Celia Payen ve Amy Sirr kabul.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
3/32″ x 7/32″ silicone tubing | VWR | 63009-260 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
1/2″ x 5/8″ silicone tubing (extra large) | VWR | 63009-299 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
1/4″ x 3/8″ silicone tubing (medium) | VWR | 63009-279 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
Orange green marprene pump tubing | Watson-Marlow | 978.0038.00+ | Tubing: Order: 6x(pack of 6) |
Female luer, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45500-04 | Connectors: Order: 4x(pack of 25) |
Male luer lock, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45503-04 | Connectors: Order: 1x (pack of 25) |
Reducing connector, PVDF, 1/4″ to 1/8″ | Cole Parmer | EW-30703-50 | Connectors: Order: 1x (pack of 10) |
Barbed Y connector, 1/8″ ID | Cole Parmer | HV-30703-92 | Connectors: Order: 3x(pack of 10) |
Medium tubing clamps | VWR | 63022-405 | Clamps: Order: 1x(pack of 12) |
Day Pinchcock (metal clamp for tubing) | VWR | 21730-001 | Clamps: Order: 1x(pack of 10) |
Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. | Fisher | 05-112-39 | Connectors: Order: 1x(pack of 25) |
Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene | Fisher | 05-112-37 | Connectors: Order: 1x(pack of 5) |
Silent Air Pumps | Aquarium Guys.com | 212422 | Air Supply: Order: 4 pumps |
PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration | Cole Parmer | HV-02915-22 | Air Supply: Order: 1x(box of 100) |
1L Flask with sidearm | Fisher | 10-181F | Air Supply: Order: 2x(Pack of 6) |
#8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks | Fisher | K953715-0801 | Air Supply: Order: 8 stoppers |
4-Port manifold | Cole Parmer | EW-06464-85 | Air Supply: Order: 8 manifolds |
55 ml Screw cap culture tubes | Corning Life Sciences | 9825-25 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48) |
Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line | Fisher | 14-817-105 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
Spinal tap needle | VWR | BD40836 | Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10) |
Regular hypodermic pink needle | Fisher | 14-817-104 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
Foam Silicone stopper size “2”, pink | Cole Parmer | EW-06298-06 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20) |
8-Well tube Rack | VWR | 82024-452 | Culture Chamber: Order: 4 racks |
10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe | VWR | 89001-530 | Media: Order: 2 or more |
Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 | Cole Parmer | EW-06298-22 | Media: Order: 2 or more |
Carboy Venting Filter | Fisher | SLFG 050 10 | Media: Order: 1x(pack of 10) |
Electrical tape, green | Amazon.com | 10851-BA-10 | Media: Order 1 roll. |
Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm | VWR | 29442-978 | Media: Order: (1 case of 12) |
5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe | VWR | 89003-384 | Media: (Optional) |
Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 | Cole Parmer | EW-06298-18 | Media: (Optional) |
205S/CA16, 16 Cartridge pump | Watson-Marlow | 020.3716.00A | Media Pump: Order: 1 |
16-channel 205CA Extension pump head | Watson-Marlow | 023.1401.000 | Media Pump: Order: 2 extension pump heads |
Silicone aquarium sealer | Fisher | S18180B | Media Pump: Order: 1 |
6-block dry bath | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16. |
Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16. |
Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm | Fisher | R04SP02500 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm | Fisher | R04SP04700 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
47 mm, large filter apparatus | Fisher | XX10 047 30 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus | VWR | 26316-692 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen | VWR | 63380-052 | Harvesting: Order: 1 (optional) |