海馬スライス培養におけるシナプス蛋白のポストエンベディング免疫金ラベリング
Summary
タンパク質の局在や分布は、細胞機能を理解するための重要な情報を提供します。電子顕微鏡の優れた空間分解能（EM）は、所定の抗原に続く免疫組織の細胞内局在を決定するために使用できます。抗原性はEM研究で特に困難であった維持しながら、構造的完全性を維持し、中枢神経系（CNS）の組織について。ここでは、ラット海馬CA1錐体細胞におけるシナプスタンパク質を研究し、特徴づけるために、CNS内の構造と抗原性を維持するために使用されている手順を採用しています。
Abstract
免疫電子顕微鏡法は、細胞内レベルでの生体分子を研究するための強力なツールです。コロイド金として電子密度の高いマーカーに結合する抗体は、様々な組織1に特異的な抗原の局在や分布を明らかにすることができます。 2つの最も広く使用される技術は、事前埋め込みとポストエンベディング手法です。それが埋め込まれる前に事前に埋め込ん免疫金電子顕微鏡（EM）技術において、組織は、抗体の浸透を可能にするために透過処理されなければならない。これらの技術は、構造体を保持するための理想的であるが、抗体の貧しい浸透（多くの場合のみ、最初の数マイクロメートル）はかなりの欠点は2である。標識は抗原がより簡単にアクセス可能です固定された組織の切片上で行われるため、ポスト埋め込み標識方法は、この問題を回避することができます。長年にわたり、多くの修正は、免疫反応を増強し、超微細構造を維持するために、ポスト埋め込み方法を改善している<suP> 3-5。
組織固定は、EM研究の重要な部分です。固定剤は、化学的な場所に組織構造をロックするために高分子を架橋する。固定剤の選択は、構造上の保全だけでなく、抗原性とコントラストだけでなく、影響を与えます。四酸化オスミウム（OSO 4）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドは、中枢神経系（CNS）の化学的および物理的処理中に構造的な損傷に特に傾向がある組織も含めて、何十年も標準固定剤であった。残念なことに、OSO 4は反応性が高く、貧しいと不十分なラベルで、その結果、抗原6をマスクすることが示されている。化学固定を避けるための代替的なアプローチは、組織を凍結することが含まれる。しかし、これらの技術は、高価な機器を実行して、必要とすることは困難である。これらの問題のいくつかに対処し、CNS組織のラベリング、Phend らを改善することができます 。酢酸ウラニル（UA）とタンニンACIとOSO 4を置き換えD（TA）は、正常脳と脊髄組織7における抗原検出と構造保全の感度を改善するために追加の変更を導入しました。我々は、ラット脳組織にこのオスミウムフリーポスト埋め込み方法を採用してシナプス蛋白を検出し、研究するための免疫金標識技術を最適化しました。
我々はここでラット海馬CA1錐体細胞におけるシナプスタンパク質の電顕的局在を決定する方法を提案する。私たちは、器官培養海馬スライスを使用。これらのスライスは、海馬のtrisynaptic回路を維持、したがってシナプス可塑性を研究するために特に有用であり、機構が広く、学習と記憶の根底にあると思った。生後5日目と6マウス/ラット仔から器官海馬スライスは、以前8記載のように調製し、そして急性ノックダウンまたは過剰発現する外来タンパク質に特に有用であることができます。我々は以前にchにこのプロトコルを使用しているニューロ（NG）、シナプス機能8,9を調節するのに重要な役割を持つ神経細胞に特異的なタンパク質をaracterize。我々はまた、カルモジュリン（CaM）とCa 2 + /カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII（CaMKII）10の電顕的局在を特徴づけるためにそれを使用している。結果に示されるように、このプロトコルは、樹状突起棘と背骨8内での分布を特徴づけるのに役立つNGの効率的な標識の良い超微細構造保存することができます。また、ここで説明する手順では、ニューロンの機能に関与する他の多くのタンパク質の研究に広く適用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、我々は、ラット海馬スライス培養における樹状突起棘を研究するために、脳や脊髄組織のためPhendおよびWeinberg法を採用しております。海馬CA3-CA1領域における樹状突起棘が神経機能の調節に重要な役割を果たすタンパク質の広大な様々なを含む繊細な構造になっています。提示された方法は合理的な標識効率及び脊椎内の特定の抗原の分布を特徴づけるための有用な良?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、海馬スライス培養物の調製のためにマシューフィレンツェに感謝したいと思います。この作品は、米国国立老化研究所とNZGにアルツハイマー病協会からの補助金によって支えられている。
Materials
| NAME OF REAGENT | COMPANY | CATALOG NUMBER | |
| 60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
| Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
| 100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
| 96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
| Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |
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