Hipokampal Dilim Kültürleri Synaptic Proteinler Post-gömme immunogold Etiketleme
Summary
Proteinlerin lokalizasyonu ve dağıtım onların hücresel fonksiyonları anlamak için önemli bilgiler sağlar. Elektron mikroskobu üstün çözünürlük uzaysal (EM), belirli bir antijen aşağıdaki immünohistokimya hücre içi lokalizasyonu belirlemek için kullanılabilir. Sürdürmek antijenite EM araştırmalarda özellikle zor olmuştur süre yapısal bütünlüğünü koruyarak merkezi sinir sistemi (MSS), dokular için. Burada, çalışma MSS yapılar ve antijenleri korumak ve sıçan hipokampal CA1 piramidal nöronlarda sinaptik proteinleri karakterize etmek için kullanılan bir yöntemle kabul.
Abstract
Immunoelectron mikroskopi Subselüler düzeyde biyolojik moleküllerin okumak için güçlü bir araçtır. Gibi kolloidal altın gibi elektron-yoğun işaretleri birleştiğinde antikorlar çeşitli dokularda 1 spesifik antijenlerin lokalizasyonu ve dağılımı ortaya çıkarabilir. İki en yaygın olarak kullanılan teknikler öncesi ve sonrası gömme gömme teknikleri vardır. Ön gömme İmmünogold-elektron mikroskobu (EM) teknikleri, doku içine gömülü önce antikor penetrasyonu izin permeabilize gerekir. Bu teknikler yapılar fakat antikorun kötü penetrasyon (genellikle sadece ilk birkaç mikrometre) bir önemli dezavantajı, 2 'dir korumak için idealdir. Antijenleri daha kolay erişilebilir yerlerde etiketleme sabit dokuların bölümlerinde yer alır, çünkü post-gömme etiketleme yöntemleri bu sorunu önleyebilirsiniz. Yıllar boyunca, bir sayı değiştirme immunoreaktivitesi geliştirmek ve ultrastrüktürel korumak için post-gömme yöntemleri geliştirdik <sup> 3-5.
Doku fiksasyonu EM çalışmalarının önemli bir parçasıdır. Fiksatifler kimyasal yerinde dokuları kilitlemek için makromoleküller çapraz bağlar. Sabitleştirici seçimi yapısal koruma, aynı zamanda antijenite ve kontrast sadece etkiler. Osmium tetroksit (Oso 4), formaldehid ve glutaraldehid merkezi sinir sistemi (MSS) fiziksel ve kimyasal işleme sırasında yapısal hasar özellikle yatkındır dokular dahil olmak üzere, yıllardır standart fiksatif olmuştur. Ne yazık ki, 4 Oso yüksek bir reaktiviteye sahip olduğu ve zayıf ve yetersiz etiketleme ile sonuçlanan, antijenler 6 maskelemek için gösterilmiştir. Kimyasal sabitleme önlemek için alternatif yaklaşımlar dokuların donma içerir. Ancak bu teknikleri pahalı enstrümantasyon gerçekleştirmek ve ihtiyaç zordur. Bu sorunların bazıları ele almak ve CNS doku etiketleme, Phend ark geliştirmek. uranil asetat (UA) ve tannik aci ile Oso 4 değiştirilird (TA) ve başarıyla antijen saptama ve beyin ve omurilik dokularının 7 yapısal koruma duyarlılığı artırmak için ek modifikasyon tanıttı. Biz sıçan beyin dokusu için bu osmiyum-ücretsiz post-gömme yöntemi benimsemiş ve sinaptik proteinleri tespit etmek ve incelemek için İmmünogold etiketleme tekniği optimize ettik.
Biz burada sıçan hipokampal CA1 piramidal nöronları sinaptik proteinlerin ultrastrüktürel lokalizasyonu belirlemek için bir yöntem mevcut. Biz organotipik hipokampal kültürlü dilim kullanabilirsiniz. Bu dilimler hipokampusun trisynaptic devresi korumak ve dolayısıyla sinaptik plastisite çalışmak için özellikle yararlıdır, bir çok mekanizma öğrenme ve hafıza rol oynadığı düşünülmektedir. Doğum sonrası 5 ve 6 fare / sıçan yavrular Organik tip hipokampal dilimleri 8 önceden tarif edildiği gibi hazırlanmış, ve akut devirme veya overexpress ekzojen proteinler için özellikle kullanışlı olduğu saptanmıştır. Biz daha önce ch için bu protokolü kullandıkneurogranin (Ng), sinaptik fonksiyon 8,9 düzenlenmesinde kritik bir role sahip bir nöron-spesifik protein aracterize. Biz de kalmodulin (CaM) ve Ca 2 + / CaM-bağımlı protein kinaz II (CaMKII) 10 ultrastrüktürel lokalizasyonu karakterize etmek için kullanmıştır. Sonuç olarak gösterildiği gibi, bu protokol dendritik omurga ve omurga 8 dağıtım karakterize yardımcı olmak için Ng etkili etiketleme iyi bir ince yapı koruma sağlar. Ayrıca, burada açıklanan işlemden nöronal fonksiyonları içinde yer alan birçok diğer proteinler okuyan geniş uygulanabilirliği olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, biz sıçan hipokampal dilim kültürlerde dendritik dikenler okumak beyin ve omurilik dokularının için Phend ve Weinberg yöntemi benimsemiştir. Hipokampal CA3-CA1 bölgesinde dendritik dikenler nöronal fonksiyonları düzenleyen önemli roller oynamaktadır proteinlerin geniş bir çeşitlilik içeren hassas yapılarıdır. Sunulan yöntem makul etiketleme verimliliği ve omurga içindeki spesifik antijenlerin dağılımı karakterize için yararlıdır iyi tekrarlanabilirlik izin, iyi ultrastrüktü…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar hipokampal dilim kültürlerin hazırlanması için Matthew Floransa teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, ABD Ulusal Yaşlanma Enstitüsü ve NZG Alzheimer Derneği bağışları ile desteklenmiştir.
Materials
| NAME OF REAGENT | COMPANY | CATALOG NUMBER | |
| 60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
| Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
| 100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
| 96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
| Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |
References
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).
- Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).
- Berryman, M. A. Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).
- Akagi, T., et al. Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses. J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).
- Stirling, J. W. Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution. J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).
- Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. Embo J. 28, 3027-3039 (2009).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
- Zhong, L., Gerges, N. Z. Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation. PloS one. 7, e41275 (2012).
- Horisberger, M., Vauthey, M. Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin. Histochemistry. 80, 13-18 (1984).
- Bendayan, M. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology. Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).
- Racz, B., Weinberg, R. J. Spatial organization of coflin in dendritic spines. J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).
- Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections. J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).
- Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5′-nucleotidase in frozen thin sections. Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 .
- Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. [Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency]. Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).
- Kehle, T., Herzog, V. Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation. Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).
- Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. Electron Microscopy. 30, (1992).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses. J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).
- Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism. Brain Research. 328, 381-385 (1985).
- Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity. Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).
- Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , 383-426 (1999).
