Post-embedding immunogold merking av Synaptic Proteiner i hippocampus Slice kulturer

Summary

Lokalisering og fordeling av proteiner gir viktig informasjon for å forstå deres cellulære funksjoner. Den overlegne romlig oppløsning av elektronmikroskopi (EM) kan brukes til å bestemme den subcellulære lokalisering av en gitt antigen etter immunhistokjemi. For vev i sentralnervesystemet (CNS), bevare strukturell integritet samtidig opprettholde antigenisitet har vært spesielt vanskelig i EM studier. Her har vi adoptert en prosedyre som har blitt brukt til å bevare strukturer og antigener i CNS å studere og karakterisere synaptiske proteiner i rotte hippocampus CA1 pyramidale nevroner.

Abstract

Immunoelectron mikroskopi er et kraftig verktøy for å studere biologiske molekyler på subcellulære nivå. Antistoffer koblet til elektron-tette markører som kolloidalt gull kan avsløre lokalisering og fordeling av spesifikke antigener i forskjellige vev ^1. De to mest brukte teknikkene er pre-embedding og post-embedding teknikker. I pre-embedding immunogold-elektron mikroskopi (EM) teknikker, må vev permeabilized å tillate antistoff penetrasjon før det er innebygd. Disse teknikkene er ideelle for å bevare strukturer, men dårlig penetrasjon av antistoffet (ofte bare de første få mikrometer) er en betydelig ulempe ^2. Post-innebygging merking metoder kan unngå dette problemet, fordi merking foregår på deler av faste vev der antigener er lettere tilgjengelig. Gjennom årene har en rekke modifikasjoner forbedret post-innebygging metoder for å forbedre immunoreaktivitet og for å bevare ultrastructure <sup> 3-5.

Tissue fiksering er en viktig del av EM studier. Fiksativer kjemisk tverrbinde de makromolekyler å låse vevsstrukturer på plass. Valget av bindemiddel påvirker ikke bare strukturelle bevaring, men også antigenisitet og kontrast. Osmiumtetroksyd (OSO _4), formaldehyd og glutaraldehyd har vært standard fiksativer i flere tiår, herunder for sentralnervesystemet (CNS) vev som er spesielt utsatt for strukturell skade under kjemiske og fysisk behandling. Dessverre er OSO ₄ svært reaktiv og har vist seg å maskere antigener ^6, som resulterer i dårlig og utilstrekkelig merking. Alternative tilnærminger for å unngå kjemisk fiksering inkluderer frysing av vev. Men disse teknikkene er vanskelig å utføre og krever kostbar instrumentering. Å ta opp noen av disse problemene og for å forbedre CNS vev merking, Phend et al. erstattet OSO ₄ med uranyl acetate (UA) og tannic ACId (TA), og hell innført ytterligere modifikasjoner for å forbedre følsomheten av antigen deteksjon og strukturell bevaring i hjernen og ryggmargen vev ^7. Vi har vedtatt dette osmium-free post-embedding metode for å rotte hjernevev og optimalisert immunogold merking teknikk for å oppdage og studere synaptiske proteiner.

Vi presenterer her en metode for å bestemme lokalisering av ultrastructural synaptiske proteiner i rotte hippocampus CA1 pyramidale neuroner. Vi bruker organotypic hippocampus dyrkede skiver. Disse skivene opprettholde trisynaptic krets av hippocampus, og således er spesielt nyttige for å studere synaptisk plastisitet, en mekanisme allment antatt å underlie læring og hukommelse. Organotypic hippocampus stykker fra postnatal dag 5 og 6 mus / rotteunger kan fremstilles som beskrevet tidligere ^8, og er spesielt nyttige til akutt knockdown eller overuttrykker eksogene proteiner. Vi har tidligere brukt denne protokollen til characterize neurogranin (Ng), en neuron-spesifikk protein med en avgjørende rolle i å regulere synaptic funksjon ^8,9. Vi har også brukt den til å karakterisere ultrastructural lokalisering av calmodulin (CAM) og Ca ^{2 +} / CAM-avhengig protein kinase II (CaMKII) ^10. Som illustrert i resultatene, tillater denne protokollen god ultrastructural bevaring av dendrittiske spines og effektiv merking av Ng som hjelper karakterisere sin fordeling i ryggraden ^8. Videre kan fremgangsmåten som er beskrevet her har bred anvendelighet i å studere mange andre proteiner involvert i nevronale funksjoner.

Protocol

1. Fiksering Fiksativ er kreftfremkallende, hansker og håndtere fiksativ i en avtrekkshette. Ikke annet er angitt, er alle inkubasjoner gjort på is og alle løsninger bør filtreres før bruk. Bruk elektron mikroskopi-grade reagenser. Dag 1 Etter eksperimentelle betingelser (f.eks viral injeksjon, narkotikabehandling), plasserer membranen med organotypic hippocampus stykker i en 60 x 15 mm polystyren petriskål inneholdende…

Representative Results

Figur 2b viser et eksempel på fordeling av endogene Ng molekyler i dendrittiske spines av CA1 hippocampus pyramidale nevroner. Nikkel gitrene supertynt (60 nm) vev inneholdende CA1 regionen av hippocampus (som sett i figur 2A) ble dekket i en% T / PB, 50 mM glycin, deretter blokkert med 2,5% BSA og 2,5% serum før inkubasjon med anti -Ng antistoff. Etter vasking med T / PB ble tavler deretter dekket i anti-kanin sekundært antistoff koplet til 10 nm gull. Til slutt ble rutenett vasket …

Discussion

I denne protokollen, har vi innført Phend og Weinberg metode for hjernen og ryggmargen vev for å studere dendrittiske spines i rotte hippocampus skive kulturer. Dendrittiske spines i hippocampus CA3-CA1 området er skjøre strukturer som inneholder et stort utvalg av proteiner som spiller viktige roller i å regulere nevrale funksjoner. Den presenterte fremgangsmåte gir et balansert tilnærming for å oppnå forbedret antigenisitet samtidig opprettholde god ultrastructural bevaring (figur 2A), som ti…

Materials

NAME OF REAGENT	COMPANY	CATALOG NUMBER
60 x 15 mm polystyrene Petri dish	Falcon	351007
Disposable scalpel	EXELINT	29552
Cell culture inserts	Millipore	PICM03050
10 nm Goat-anti-rabbit gold	Electron Microscopy Sciences	25108
Anti-Neurogranin antibody	Millipore	AB5620
100% Picric acid	Electron Microscopy Sciences	19550
96% Paraformaldehyde	Acros Organics	AC41678-0030
25% Glutaraldehyde (EM grade)	Sigma	G5882
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
p-Phenylenediamine	Sigma	P6001
Platinum (IV) chloride	Sigma	379840
Tannic acid	Electron Microscopy Sciences	21710