Generatie van hoge kwaliteit Chromatine immunoprecipitatie DNA Template voor High-throughput sequencing (ChIP-seq)

Summary

De combinatie van chromatine immunoprecipitatie en ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) kan identificeren en in kaart eiwit-DNA-interacties in een bepaald weefsel of cellijn. Geschetst is hoe je een hoge kwaliteit ChIP sjabloon voor de daaropvolgende sequencing, met ervaring met de transcriptiefactor TCF7L2 als een voorbeeld te genereren.

Abstract

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methoden de rechtstreeks hele genoom dekking, waarbij een combinatie chromatine immunoprecipitatie (ChIP) en massaal parallel sequencing kan worden gebruikt om het repertoire van zoogdier-DNA-sequenties van transcriptiefactoren in vivo gebonden identificeren. "Next-generation" genoom sequencing technologieën bieden 1-2 ordes van grootte verhoging van het bedrag van de sequentie die kan worden kosteneffectief gegenereerd dan oudere technologieën waardoor voor ChIP-seq methoden om rechtstreeks te bieden het hele genoom dekking voor effectieve profilering van zoogdieren eiwit-DNA interacties.

Voor een succesvolle ChIP-seq benaderingen, moet men het genereren van hoge kwaliteit ChIP DNA-template om de beste sequencing resultaten te verkrijgen. De beschrijving is gebaseerd op ervaring met het eiwitproduct van het gen sterkst betrokken bij de pathogenese van type 2 diabetes, namelijk de transcriptiefactor transcriptiefactor 7-like 2 (TCF7L2). Deze factor is ook betrokken bij verschillende soorten kanker.

Geschetst is hoe hoge kwaliteit ChIP DNA template afgeleid van de colorectale carcinoma cellijn HCT116 genereren, om een ​​hoge-resolutie-kaart bouwen door sequencing de genen van TCF7L2 gebonden bepalen nadere inzicht in de belangrijke rol in de pathogenese van complexe eigenschappen.

Introduction

Al vele jaren is er een onvervulde behoefte aan de set van genen verbonden en geregeld door een bepaald eiwit genomische, met name in de transcriptie factor klasse identificeren.

Odom et al.. ¹ gebruikte chromatine immunoprecipitatie (ChIP) gecombineerd met promotor microarrays om de genen bezet door vooraf gespecificeerde transcriptieregulatoren in menselijke lever en alvleesklier eilandjes systematisch te identificeren. Vervolgens Johnson et al.. ² ontwikkelde een grootschalige chromatine immunoprecipitatie assay gebaseerd op directe ultra high-throughput DNA-sequencing (ChIP-seq) om een uitvoerig in kaart eiwit-DNA-interacties over het hele zoogdieren genomen. Als een test case, zij toegewezen in vivo de binding van de neuron-restrictieve silencer factor (NRSF) tot 1946 locaties in het menselijk genoom. De weergegeven gegevens scherpe resolutie van binding positie (+ 50 basenparen), die zowel de i vergemakkelijktvertroosting van motieven en de identificatie van NRSF-bindende motieven. Deze ChIP-seq data had ook een hoge gevoeligheid en specificiteit en statistische betrouwbaarheid (P <10 ^-4), eigenschappen die belangrijk zijn voor het afleiden van nieuwe kandidaat-interacties zijn.

Robertson et al.. ³ ook ChIP-seq om STAT1 doelen in kaart interferon-γ (IFN-γ)-gestimuleerde en ongestimuleerde humane HeLa S3 cellen in vivo. Door ChIP-seq, met 15,1 en 12,9 miljoen unieke toegewezen sequentieaflezingen en schatting valse ontdekking van minder dan 0,001, identificeerden zij 41.582 en 11.004 vermoedelijke STAT1-bindende regionen gestimuleerde en ongestimuleerde cellen. Van de 34 loci bekend STAT1 interferon-responsieve bindingsplaatsen ^4-8 bevatten, ChIP-seq gevonden 24 (71%). Werden ChIP-seq doelen verrijkt in sequenties vergelijkbaar met bekende STAT1 bindingsmotieven. Vergelijkingen met twee bestaande chip-PCR datasets voorgestelddat ChIP-seq sensitiviteit tussen 70% en 92% en specificiteit ten minste 95%. Bovendien, was het duidelijk dat ChIP-seq biedt zowel lage analytische complexiteit en gevoeligheid die toeneemt met sequencing diepte.

Als zodanig, "next-generation" genoom sequencing technologieën bieden 1-2 ordes van grootte verhoging van het bedrag van de sequentie die kosteneffectief gegenereerd dan oudere technologieën ⁹ kunnen zijn. ChIP-seq methoden dan ook direct leveren hele genoom dekking voor effectieve profilering van zoogdieren afkomstig eiwit-DNA-interacties ^3.

In 2006, werd een sterke associatie van varianten in de transcriptiefactor 7-achtige 2 (TCF7L2) gen met type 2 diabetes ontdekt ^10. Andere onderzoekers hebben reeds onafhankelijk gerepliceerd deze bevinding in verschillende etniciteiten en, interessant, vanaf de eerste genome wide association studies van type 2 diabetes gepubliceerd in Nature ^11,12 </sup>, Wetenschap ^13-15 en elders ^16,17, de sterkste associatie was inderdaad met TCF7L2; dit wordt nu beschouwd als de meest significante genetische bevinding bij type 2 diabetes tot nu ^18-20. Bovendien is TCF7L2 verbonden met kankerrisico ^21,22, ja, werd duidelijk dat dit verbreken als 8q24 locus onthuld door genoomwijde associatiestudies van verschillende kankers, waaronder colorectale carcinomen, werd aangetoond dat door een extreme upstream TCF7L2-bindend element besturen van de transcriptie van MYC ^23,24. Als zodanig is er grote belangstelling voor het bepalen van de downstream genen gereguleerd door deze belangrijke transcriptiefactor.

Gebaseerd op ervaring met TCF7L2 als een voorbeeld van de methodologie, dit document wordt beschreven hoe u een hoge kwaliteit ChIP DNA-template te genereren. ChIP werd in het colorectaal carcinoom cellijn HCT116 uitgevoerd, voor daaropvolgende sequencing om het opbouwen van een hoge resolution kaart van de genen door TCF7L2 ²⁵ gebonden in een poging om meer inzicht te geven in haar belangrijke rol in de pathogenese van complexe eigenschappen.

Protocol

1. Cross-Link Chromatin Groeien cellen in 100x20mm celcultuurschalen. De hoeveelheid cellen kan variëren van 1 tot 10 miljoen cellen per schaal afhankelijk van het celtype. Ongeveer 2 miljoen cellen is voldoende voor een immunoprecipitatie. Kruislings gekoppelde cellen in 1% formaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met af en toe schudden. Quench verknoping door toevoeging van een uiteindelijke concentratie van 125 mM Glycine en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatu…

Representative Results

Zodra het chromatine is gesonificeerd en behandeld met RNase en proteïnase bij de monsters lopen op 2% agarose gel uitstrijk vertonen met de massa van het DNA op de gewenste grootte. Indien meerdere cycli getest, een geleidelijke afname in grootte worden beschouwd als het aantal werkcycli verhogen (Figuur 2). Na het voltooien van de immunoprecipitatie gedeelte van het protocol de verrijking ofwel kan worden gecontroleerd door middel van PCR of real-time PCR. Voor PCR monste…

Discussion

Het is nu mogelijk om een genoom-brede profiel van eiwit-DNA-interacties vereniging met ChIP-seq uit te voeren, zoals is zeer onlangs aangetoond met andere transcriptiefactoren ^2,3. De sleutel tot een succesvolle sequencing resultaat is het genereren van een hoge kwaliteit chromatine immunoprecipitatie DNA template.

Zodra de DNA-template is gegenereerd en vastgesteld op adequate wijze worden verrijkt, kan men dan nemen het in voorbereiding bibliotheek voor daaropvolgende sequencin…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
EZ-ChIP Kit	Millipore	17-371
GoTaq Hot Start Polymerase	Promega	M5001
Misonix Sonicator	Qsonica	XL-2000
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo-Scientific
			Positive control primer sequences (TCF7L2-1) Forward- 5′-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3′ Reverse- 5′-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3′ Negative control primer sequences (CTRL-1) Forward-5′-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3′ Reverse- 5′-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3′