हम वर्णन कैसे लेजर कब्जा microdissection (LCM) का उपयोग करने के लिए या घायल बाद जीन की अभिव्यक्ति विश्लेषण मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर और / या पूरे जीनोम प्रोटीन का उपयोग करने के लिए चूहे के मस्तिष्क के जमे हुए वर्गों से hippocampal न्यूरॉन्स एकल न्यूरॉन्स की समृद्ध आबादी प्राप्त.
TBI के बाद लंबी अवधि के संज्ञानात्मक विकलांगता चोट प्रेरित हिप्पोकैम्पस – एक औसत दर्जे का टेम्पोरल लोब कि सीखने और स्मृति, और कार्यकारी समारोह के लिए महत्वपूर्ण है में क्षेत्र में neurodegeneration के साथ जुड़ा हुआ है. 1,2 इसलिए हमारे अध्ययन विशिष्ट neuronal जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित हिप्पोकैम्पस के अलग उपक्षेत्र में आबादी. लेजर पर कब्जा microdissection (LCM), Emmert – बक द्वारा 1996 में शुरू की तकनीक, एट अल. 3 एकल कक्षों के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में उल्लेखनीय प्रगति के लिए अनुमति दी गई है और समृद्ध स्तनधारी मस्तिष्क जिसमें रूप में विषम ऊतकों से कोशिकाओं की आबादी कार्यात्मक सेल प्रकार के हजारों 4. हम LCM और एक अच्छी तरह से स्थापित घाव मस्तिष्क की चोट (TBI) के चूहे मॉडल के आणविक तंत्र कि TBI के रोगजनन आबाद की जांच का उपयोग करें. तरल पदार्थ टक्कर TBI के बाद दिमाग में पूर्व निर्धारित समय पर चोट के बाद हटा रहे हैं, तुरंत सूखी बर्फ पर जमे हुए है,और एक cryostat में सेक्शनिंग के लिए तैयार है. चूहे के दिमाग अक्टूबर और sectioned में एम्बेड किया जा सकता है तुरंत, या -80 पर कई महीनों संग्रहीत डिग्री सेल्सियस लेजर कब्जा microdissection के लिए सेक्शनिंग पहले. इसके अतिरिक्त, हम circadian लय पर TBI के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए LCM का उपयोग करें. इस के लिए, हम suprachiasmatic नाभिक से न्यूरॉन्स है कि स्तनधारी मस्तिष्क के मास्टर घड़ी होते कब्जा. यहाँ, हम LCM का उपयोग करने के लिए वास्तविक समय पीसीआर और / एक की पहचान (और घायल degenerating, फ्लोरो जेड – सकारात्मक, या रिहाई, फ्लोरो जेड नकारात्मक) न्यूरॉन्स और बाद जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए hippocampal न्यूरॉन्स के समृद्ध आबादी प्राप्त प्रदर्शित या पूरे जीनोम प्रोटीन. इन LCM सक्षम अध्ययन से पता चला है कि चूहे हिप्पोकैम्पस की anatomically अलग क्षेत्रों के चुनिंदा भेद्यता LCM द्वारा इन अलग – अलग क्षेत्रों से प्राप्त न्यूरॉन्स के विभिन्न आबादी के विभिन्न जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल में परिलक्षित होते हैं. हमारे एकल कोशिका अध्ययन, जहां से परिणामहम मर रहा है और आसन्न hippocampal न्यूरॉन्स जीवित transcriptional प्रोफाइल की तुलना, कि TBI के बाद कोशिका मृत्यु और अस्तित्व को नियंत्रित एक सेल अस्तित्व रिओस्तात के अस्तित्व का सुझाव.
विषम ऊतकों के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण हमेशा समस्याग्रस्त किया गया है, यह स्तनधारी दिमाग है, जो लगभग 5000 विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में विशेष रूप से सच है 4 लेजर कब्जा (LCM) microdissection तकनीक, TBI के प्रभाव के जीनोमिक अध्ययन के विकास के लिए पहले vivo में जीन की अभिव्यक्ति के मस्तिष्क शामिल कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी में न केवल अलग neuronal सेल प्रकार की है, लेकिन यह भी glial और immunomodulatory कोशिकाओं का समर्थन करने का विश्लेषण पर आधारित थे. जिसके परिणामस्वरूप जटिल जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल इन विषम ऊतकों से प्राप्त किया, और चोट प्रेरित सेलुलर संकेतों के अक्सर विरोधाभासी पैटर्न 5 TBI के पूर्व नैदानिक अध्ययन में प्रभावी सिद्ध चिकित्सकीय रणनीति के मानव नैदानिक परीक्षणों में विफलता के लिए एक व्याख्या हो सकती है
न्यूरॉन्स की कमजोर आबादी में चूहा कूल्हे से चोट प्रेरित जीन की अभिव्यक्ति का एक स्पष्ट समझ प्राप्तpocampus, हम LCM की तकनीक, 3 1 Emmert बक एट अल द्वारा की सूचना दी. बाद में, हम संशोधित और अनुकूलित न्यूरॉन्स और mRNA रूपरेखा के लिए एकल न्यूरॉन्स मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर और माइक्रोएरे विश्लेषण का उपयोग करने की समृद्ध आबादी के कुशल पर कब्जा करने के लिए इस तकनीक microdissection अपनाया . जीनोमिक विश्लेषण के लिए मस्तिष्क के ऊतकों के जमे हुए वर्गों में mRNA की अखंडता को बनाए रखने के लिए, हम फिक्सिंग, धुंधला और जमे हुए चूहे के मस्तिष्क वर्गों से न्यूरॉन्स का तेजी से कब्जा के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल संशोधित. पहचान और घायल और मर hippocampal न्यूरॉन्स के अलगाव के लिए, हम भी Fluoro जेड LCM के लिए धुंधला हो जाना तकनीक अनुकूलित. Fluoro जेड apoptotic और परिगलित कोशिका मृत्यु के बीच भेद नहीं करता. इस प्रकार, degenerating न्यूरॉन्स के सभी प्रकार के दाग. 6,7 द्वारा पाया जा सकता है
यहाँ, हम हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल के लिए एकल मरने या जीवित न्यूरॉन्स के पूल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समृद्ध populati के swaths प्राप्त प्रोटोकॉल का वर्णनons अलग neuronal सेल प्रकार (यानी TBI के बाद CA1 CA3 विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति न्यूरॉन्स). तरल पदार्थ टक्कर मस्तिष्क चोट हमारी प्रयोगशाला में प्रदर्शन के लिए प्रक्रिया Shimamura एट अल., 8 में विस्तार से वर्णित है और बहुत पार्श्व द्रव टक्कर Alder एट अल द्वारा जौव में प्रकाशित चूहों के लिए चोट प्रोटोकॉल के लिए इसी तरह की है LCM तकनीक है के बाद से. 9 शाही सेना और ऊतकों में प्रोटीन, डीएनए की अखंडता पर कम या कोई प्रभाव नहीं दिखाया गया है, यह परिभाषित सेल प्रकार की आणविक और प्रोटीन के विश्लेषण के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है.
इस LCM तकनीक हमें सक्षम है TBI के आणविक तंत्र को समझने में महत्वपूर्ण प्रगति कर 8,10,11,12,13 हम पहली बार इस तकनीक का उपयोग करने के लिए दिखाना है कि चूहे हिप्पोकैम्पस की अलग उपक्षेत्र जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल जांचकर्ताओं थे कि उनकी चोट के लिए चयनात्मक भेद्यता के साथ सहसंबंधी. हमारे अध्ययन से पता चला है कि हम जीन की अभिव्यक्ति यों qPCR द्वारा सकता है, के रूप में कुछ के रूप में 10 लेजर कब्जा कोशिकाओं से और है कि हम कम से कम 600 कोशिकाओं के रूप में कब्जा कर लिया से जीनोम चौड़ा माइक्रोएरे विश्लेषण प्रदर्शन कर सकता है. LCM अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों है कि विविध तंत्रिका विज्ञान और neuropsychiatric विकारों में फंसा हो जाना जाता है की इसी तरह के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण उपकरण होगा. उदाहरण के लिए, का उपयोग करते हुए अध्ययन LCM substantia nigra, 14 की dopamine न्यूरॉन्स में पार्किंसंस रोग के रोगजनन में प्रकाश डाला है और सहायता प्राप्त जीनोम चौड़ा नाभिक accumbens की रूपरेखा अध्ययन, जो इनाम एस में फंसा सर्किट में शामिल हैubstance सेवन विकारों. 15
Neuronal विजातिता जीनोम 16 स्तर पर परिलक्षित होता है और नैदानिक परीक्षणों में TBI के लिए प्रयोगात्मक उपचार की सफलता की कमी के लिए योगदान कर सकते हैं. इस प्रकार, हमारे लक्ष्य के लिए इस तकनीक का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण TBI के बाद neuronal अस्तित्व को प्रभावित तत्वों की जांच की है. हमारे हाल के जीनोम चौड़ा मर रहा है और आसन्न TBI के बाद hippocampal न्यूरॉन्स जीवित की रूपरेखा अध्ययन का सुझाव दिया है कि एक सेलुलर रिओस्तात है कि कोशिका मृत्यु जीन सेल अस्तित्व की अभिव्यक्ति के स्तर के अनुपात को दर्शाता TBI के बाद सेल भाग्य को नियंत्रित. ये चल रही पढ़ाई और pharmacotherapeutic रणनीति है कि सकारात्मक सेल अस्तित्व रिओस्तात को प्रभावित कर सकते हैं के डिजाइन और विकास के लिए योगदान देगा. इसके अलावा, हम वर्तमान में LCM का उपयोग करने के लिए ट्रैक और TBI के बाद hippocampal न्यूरॉन्स में संभावित चिकित्सकीय दवा उपचार के प्रभाव की निगरानी. इस प्रकार, हमारे अध्ययन यह देखते हुए कि सावधान RNase मुक्त हैंडलिंग तकनीक और कुछ का प्रदर्शनमौजूदा प्रोटोकॉल के संशोधन, यह सटीक मात्रात्मक विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति LCM से उच्च गुणवत्ता शाही सेना के नमूने प्राप्त करने के लिए संभव है.
लेकिन वहाँ कुछ LCM तकनीक के साथ जुड़े नुकसान कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, किसी भी microglia संदूषण के बिना केवल neuronal कोशिकाओं एकत्रित लगभग असंभव हो सकता है. हिप्पोकैम्पस के पिरामिड सेल परत में यह अनुमान लगाया गया है कि इस आबादी का 90% के साथ कोशिकाओं के 95% न्यूरॉन्स pyramidal कोशिकाओं और 10% interneurons glial और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के एक छोटे प्रतिशत छोड़ने 8,17 हैं, 18 हमारे अध्ययन में हम Fluoro जेड एक फ्लोरोसेंट रंजक है कि विशेष रूप से मस्तिष्क के ऊतकों में ही घायल न्यूरॉन्स लेबल का उपयोग करें. एक अलग दाग कि GFAP के लिए एक मार्कर है microglia दाग करने के लिए आवश्यक हो सकता है 19 केवल Fluoro जेड दाग एकल neuronal निकायों एकत्रित न्यूरॉन्स की एक अधिक समरूप जनसंख्या सुनिश्चित होगा. एक अन्य आम समस्या है कि समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है कि एक चक्र नहीं हैटी परिभाषित जब लेजर निकाल दिया है. यदि ऐसा होता है, यह लेजर सेटिंग्स की जाँच के लिए और आवश्यक के रूप में शक्ति और अवधि को समायोजित करने के लिए आवश्यक है. इसके अलावा यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि टोपी फ्लैट ऊतक पर रखा जाता है और हाथ में सही ढंग से बैठा. LCM तकनीकी मैनुअल का हवाला देते हुए या तकनीकी सहायता बुला कभी कभी आवश्यक हो जाएगा. LCM और शाही सेना अलगाव के बाद, शाही सेना की गुणवत्ता हमेशा एक bioanalyzer का उपयोग कर किसी भी जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करने से पहले मूल्यांकन किया जाना चाहिए.
वर्तमान में बाजार पर लेजर पर कब्जा उपकरणों के कई प्रकार के होते हैं लेजर (जीवन टेक्नोलॉजीज, Leica माइक्रोसिस्टम्स) काटने और लेजर उपकरणों (Zeiss) catapulting सहित. हमारे LCM प्रणाली कोशिकाओं के छोटे संख्या पर कब्जा करने के लिए अच्छी तरह से काम करता है. अन्य उच्च throughput और अधिक स्वचालित प्रणाली और विशेष रूप से प्रोटिओमिक जीनोमिक विश्लेषण के लिए बड़ा कोशिकाओं की संख्या प्राप्त करने के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है. दरअसल, इन स्वचालित प्रणाली का उपयोग LCM जनसंपर्क के विश्लेषण के लिए महान क्षमता हैपहचान की कोशिकाओं या कोशिकाओं के समृद्ध आबादी में otein अभिव्यक्ति 20. इसके अलावा, LCM जीन immunolabeled कोशिकाओं, 21 हमें परिभाषित प्रकार की कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए भले ही सबसे विषम ऊतकों में जटिलता की अनुमति की अभिव्यक्ति विश्लेषण की सुविधा कर सकते हैं. इस प्रकार, LCM कोशिकाओं के एकल या समृद्ध आबादी की अत्याधुनिक आणविक अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है.
The authors have nothing to disclose.
यह काम R01 (HLH) NS052532, मूडी फाउंडेशन, और एनेस्थिसियोलॉजी विभाग द्वारा वित्त पोषित है. हम लॉरी बोल्ड, क्रिस्टीन Courteau बटलर और उनके संपादकीय सहायता के लिए क्रिस्टी पेरी, और लेआउट और सभी आंकड़े, टेबल, और कलाकृति के उत्कृष्ट उत्पादन के लिए पेरी क्रिस्टी धन्यवाद.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
PixCell IIe Laser Capture Microscope | Life Technologies (Arcturus) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems | LCM0211/LCM0214 | |
Fluoro-Jade | Histo-chem Inc. | #1FJ | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB pharmacy | ||
RNase free barrier pipette tips | Fisher Scientific | 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A | |
Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies) Zeiss Laser Microdissection The PALM family Leica Microsystems |