וקטורים ויראליים לאפשר למניפולצית גן ממוקדת. אנחנו מדגימים את שיטה לביטוי גנים מותנים או אבלציה בחוט שדרת העכבר, באמצעות הזרקת stereotaxic של וקטור ויראלי לקרן האחורית, אתר בולט של קשר הסינפטי בין afferents החושיים הראשוניים ועצב של מערכת העצבים המרכזית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס
במאמר זה
סיכום
תקציר
הזרקת Intraparenchymal של וקטור ויראלי מאפשרת מניפולציה גנטית מותנית באוכלוסיות שונות של תאי עצב או באזורים מסוימים של מערכת העצבים המרכזית. אנחנו מדגימים את טכניקת הזרקת stereotaxic המאפשרת ביטוי ממוקד גן או השתקה בקרן האחורית של חוט שדרת העכבר. הליך הכירורגים קצר. זה דורש laminectomy של חוליה אחת, לספק להתאוששות מהירה של בעל החיים שאינם פגומה ותנועתיות של עמוד השדרה. הזרקה מבוקרת של נפח השעית וקטור קטן במהירות ושימוש נמוך של microsyringe עם צינורית זכוכית משופעת למזער את הפגיעה ברקמות. התגובה החיסונית המקומית לווקטור תלוי במאפיינים הפנימיים של הווירוס מועסק; בניסיון שלנו, זה קל וקצר ימים, כאשר וירוס אדנו הקשורים בשימוש. גן כתב כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר מאפשר פיזור המרחבי ניטור של הווקטור, ואת היעילות והסלולרי specificity של transfection.
מבוא
טכנולוגיות מתקדמות של מניפולציה גנטית מותנית בעכבר מאפשרות גישות רבות פנים לחקר מסלולים וקשרים סינפטיים תפקודיים במערכת העצבים המרכזית. Transgenes עשוי להיות מוסדר על ידי effectors מולקולה קטנה כגון דוקסיציקלין פועלת על transactivator טטרציקלין מבוקר, אשר יכול להיות מתוכנן לתפקד כמדכא או activator של שעתוק גנים, או טמוקסיפן הכרת תחום מוטצית יגנד מחייב של קולטן אסטרוגן 1 . שינוי בלתי הפיך transgene מושגת בדרך כלל על ידי חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) recombinases. Cre (רקומבינציה סיבות) וFLP (אנזים רקומבינציה flippase) לזרז את הכריתה, היפוך או טרנסלוקציה של מקטעי דנ"א המוקפים loxP (לוקוס של x המעבר מעל, P1) או FRT (יעד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ההליך כירורגי תאר אושר על ידי בעלי החיים וטיפול המוסדי ועדת שימוש (IACUC) מאוניברסיטת קולומביה.
1. הכנת הציוד והשעית חלקיקי וירוס
- לנקות ולחטא את הציוד, לעקר את מכשירי ניתוח ואת הקוצים לחרוץ V שישמשו לתיקון החוליה L1.
- משוך וpipettes זכוכית פוע. אנו משתמשים pipettes בעלי קוטר קצה של 40 מיקרומטר והם משופעים בזווית של 20 מעלות. לעקר את pipettes הזכוכית.
- הגדרת מסגרת stereotaxic....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תשואות transfection מוצלחות ביטוי גנים בתאי עצב חזק של קרן האחורית הזרקה (איור 1), שאינו מרבה הקרן האחורית של הצד הנגדי, הקרן הבטנית וגרעיני השורש הגבו.
איור 1. Transfection של נוירונים קרן אחורית. () ביטוי של eGfp כתב הניאון (ירוק) בקרן האחורית השמאלית של חוט שדרת L4, שבועות לאחר הזרקת stereotaxic של rAAV-eGfp.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הזרקת הווקטור Stereotaxic מאפשרת מיקוד תאי עצב בחוט שדרה עבור יישומים כגון מיפוי רשת עצבית המבוסס על הנגיף מתפשט transsynaptic 6,7 או נתיחת optogenetic 8, הדרכת האקסון במהלך רגנרציה מפציעת 9,10, או טיפול גנטי למניעה או הטיפול של 11 ניוון מוחיה, 12. וקטורים נגיפיים שמשו במשך מניפולציה גנטית בחוט השדרה ללמוד מסלולים חושיים, מוטוריים ואוטונומי 9,10,13-15. העכבר הוא אורגניזם המודל הנפוץ ביותר במחקרים שכלל זריקת stereota.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
אנו מודים Bakhos א טנוס, Ph.D., מנהל פיתוח וקטור וההפקה במרכז למדעי מוח בית החולים כלליים מסצ'וסטס, Charlestown, מסצ'וסטס, שספק לנו את וקטור rAAV-eGfp, וג'ון בנג לסיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מענק R01 NS050408 (לי.ס.) מהמכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם חומר | חברה | מספר קטלוגים | |
| צלחת בסיס עמוד שדרה | דוד קופף מכשירים | 912 | |
| מכשיר stereotaxic חיה קטן | דוד קופף מכשירים | 900 | |
| בעל ראש הרדמת גז מאוס | דוד קופף מכשירים | 923-B | |
| mounts הבסיס מתכוונן | דוד קופף מכשירים | 982 | |
| קוצי V לחרוץ | דוד קופף מכשירים | 987 | |
| מערכת בקרת טמפרטורת חיה קטנה | דוד קופף מכשירים | TCAT-2LV | |
| Adson מלקחיים | כלי מדע פיין | 11006-12 | |
| מלקחי Laminectomy | כלי מדע פיין | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (1) עם SYS-Micro4 בקר | מכשירי Precision העולם | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | המילטון | 7633-01 | |
| RN דחיסה המתאימה, 1 מ"מ | המילטון | 55750-01 | |
| ורוסיליקט זכוכית נימים | מכשירי Precision העולם | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
מקורות
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
