Microfluidic चिप निर्माण और इन्फ्लुएंजा विधि का पता लगाने के
Summary
एक एकीकृत microfluidic थर्माप्लास्टिक चिप एक आणविक निदान के रूप में उपयोग के लिए विकसित किया गया है. चिप न्यूक्लिक एसिड निकासी, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस, और पीसीआर करता है. Fabricating और चिप चलाने के लिए तरीके वर्णित हैं.
Abstract
तेजी से और प्रभावी निदान प्रभावी रोगी प्रबंधन और उपचार को सक्षम करने से संक्रामक रोग को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. यहाँ, हम रोगी nasopharyngeal (एनपी) swabs और रेस्पायरेट्रस में इन्फ्लूएंजा ए वायरस बढ़ाना करने की क्षमता के साथ एक एकीकृत microfluidic थर्माप्लास्टिक चिप उपस्थित थे. रोगी नमूना लोड पर, microfluidic डिवाइस sequentially पर चिप सेल, आरएनए शोधन और ठोस चरण निष्कर्षण (SPE), रिवर्स प्रतिलेखन (आर टी) और RT-पीसीआर कक्षों में पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के भीतर एकाग्रता कदम किया जाता है, क्रमशः. अंत बिंदु का पता लगाने दूर एक चिप Bioanalyzer (टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, CA) का उपयोग किया जाता है. बाह्य उपकरणों के लिए, हम एक ही सिरिंज पंप का इस्तेमाल किया अभिकर्मक और नमूने ड्राइव, जबकि दो पतली फिल्म heaters आरटी पीसीआर और कक्षों के लिए गर्मी के स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया. चिप के लिए एक परत और उच्च throughput विनिर्माण के लिए करने के लिए उपयुक्त fabricati को कम करने के लिए बनाया गया हैसमय और लागत पर. microfluidic चिप एक वायरस और बैक्टीरिया की एक विस्तृत विविधता, अभिकर्मक डिजाइन में परिवर्तन करने के लिए ब्याज की नई रोगज़नक़ों का पता लगाने की जरूरत द्वारा ही सीमित का विश्लेषण करने के लिए एक मंच प्रदान करता है.
Introduction
20 सदी के 1 तीन इन्फ्लूएंजा महामारियां के दौरान होने वाली मौतों की लाखों सूचित किया गया है. इसके अलावा, 2009 में विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) द्वारा 2 सबसे हाल ही में फ्लू महामारी घोषित किया गया था, और 1 अगस्त, 2010 के रूप में, 18,449 लोगों की मृत्यु तीन डब्ल्यूएचओ द्वारा सूचित किया गया है. यह महामारी फिर संक्रामक रोग के उच्च बोझ है, और इन्फ्लूएंजा तेजी से और सही पता लगाने के लिए तेजी से रोग की पुष्टि, उपयुक्त सार्वजनिक स्वास्थ्य प्रतिक्रिया और प्रभावी उपचार 4 सक्षम के लिए की जरूरत का प्रदर्शन किया.
वहाँ कई तरीके हैं इन्फ्लूएंजा के निदान के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, इन तेजी immunoassays, प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट प्रतिजन परीक्षण (DFA) और वायरल संस्कृति के तरीके शामिल हैं. रैपिड immunoassays नाटकीय रूप से 5-8 संवेदनशीलता की कमी है, जबकि अन्य दो तरीकों श्रम प्रधान और समय लेने वाली 9. आणविक परीक्षणों बारी के आसपास समय, उच्च Sensit सहित कई फायदे की पेशकशivity और उच्च विशिष्टता. कई वाणिज्यिक संस्थाओं संक्रामक रोगों के लिए किया गया है तेजी से आणविक परीक्षण (भी बुलाया न्यूक्लिक अम्ल परीक्षण या NATs) की दिशा में काम कर रहा है, और उनके पाइपलाइनों में कई इन्फ्लूएंजा assays है. हालांकि उनमें से ज्यादातर बंद चिप नमूना तैयार करने की आवश्यकता है. नैदानिक प्रयोगशाला सुधार (CLIA) संशोधन माफ आणविक परीक्षण परख कारतूस या मॉड्यूल नमूना तैयार करने में शामिल में से कोई भी.
लैब-on-a-चिप प्रौद्योगिकी बिंदु का ध्यान परीक्षण उपकरणों के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. १९९३ 10 में पहली पीसीआर चिप के परिचय के बाद, कई प्रयासों न्यूक्लिक एसिड परीक्षण चिप्स के विकास में डाल दिया गया. हालांकि, इनमें से केवल कुछ बहाव के प्रवर्धन के साथ एकीकृत कच्चे नमूना तैयार करने है.
हम पहले एक प्लास्टिक microfluidic 11 चिप में एक ठोस चरण निष्कर्षण स्तंभ (SPE) के miniaturization का प्रदर्शन किया और विकसितजाहिर है और एक सतत प्रवाह पीसीआर 12 चिप के अनुकूलन. यहाँ, हम पिछले आरटी और पीसीआर चरणों का नैदानिक निदान के लिए एक सिंगल चिप में SPE और एकीकृत इसके लिए रोगी nasopharyngeal (एनपी) swabs और रेस्पायरेट्रस से न्यूक्लिक एसिड बढ़ाना क्षमता प्रदर्शित करने का काम करता हूं.
Protocol
Representative Results
Discussion
निदान पद्धति यहाँ प्रस्तुत उच्च विशिष्टता और एक कम सीमा का पता लगाने के साथ मरीज के नमूनों से इन्फ्लूएंजा ए शाही सेना को बढ़ाना एक एकीकृत microfluidic प्लास्टिक चिप की क्षमता का प्रदर्शन 13 हम ध्यान परीक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान EB008268 R01 द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number |
| 1-dodecanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 443816-500G |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 196118-50G |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | G2943CA |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 19516 |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 239852-50G |
| BSA | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | A7979-50ML |
| Butyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 235865-100 ml |
| Carrier RNA | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 |
| Cyclohexanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 105899-1L |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 |
| Ethylene dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335861 |
| Ethylene glycol dimethacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 335681-100ML |
| Glass syringe 250 μl | Hamilton, Reno, NV | 81127 |
| Guanidine thiocyanate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 50981 |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 5067-4626 |
| Hot press | Carver,Wabash, IN | 4386 |
| J-B Weld Epoxies | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 7605A11 |
| Luer-Lok syringes | BD-Medical, Franklin Lakes, NJ | 309628 |
| Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | AB-0359 |
| Methanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 494437 |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M55909 |
| Nanoport | Upchurch Scientific | N-333-01 |
| Nanoport Fitting | Upchurch Scientific | F-120x |
| Nuclease free water | Thermo Fisher Scientific,pittsburge, PA | PR-P1193 |
| OneStep RT-PCR kit | Qiagen, Valencia, CA | 210210 |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 41009 |
| Power supply | VWR,Radnor, PA | 300V |
| RNAse Away | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 83931-250ML |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 |
| Silica microspheres | Polysciences,Warrington, PA | 24324-15 |
| Syringe pump | Harvard Apparatus,Holliston, MA | HA2000P/10 |
| Thermally Conductive Tape | Mcmaster-Carr,Elmhurst, IL | 6838A11 |
| Thermocouple | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 |
| Thin-film Heaters | Minco,Minneapolis, MN | HK5166R529L12A |
| Ultraviolet Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Louisville, KY | 690R |
References
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- Wenzel, J. J., et al. Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).
- Chan, K. H., et al. Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1. Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).
- Ginocchio, C. C., et al. Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak. Journal of. 45, 191-195 (2009).
- Aeron, C. H., et al. Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses. Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).
- Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting. Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).
- Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. . Transducer’93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).
- Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics. Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).
- Cao, Q., Kim, M. -. C., Klapperich, C. Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments. Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).
- Cao, Q., et al. Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens. PLoS ONE. 7, e33176 (2012).
- Rådström, P. Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit. J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).
- Andreasen, D., et al. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, S6-S9 (2010).
